子宫颈腺癌中与生存相关的分子和表观遗传学改变：一项探索性TCGA多组学队列研究

《Current Issues in Molecular Biology》：Survival-Associated Molecular and Epigenetic Alterations in Endocervical Adenocarcinoma: An Exploratory TCGA Multi-Omics Cohort Study

　　

背景与目的：这项探索性研究的目的是利用TCGA（癌症基因组图谱）数据库中的数据，确定影响宫颈腺癌生存结局的分子特征。方法：通过cBioPortal网站访问“TCGA Firehose Legacy”数据集。由两位妇科病理学家独立评估数字化全切片图像上的SILVA浸润模式。根据总生存状态（存活 vs. 死亡）对病例进行分组。分析了体细胞突变、拷贝数改变、mRNA表达、RPPA蛋白表达和DNA甲基化谱。使用Kaplan–Meier法和log-rank检验进行生存分析，并辅以差异分析。通过g:Profiler评估通路和转录因子结合基序富集。p和q < 0.05被认为具有统计学意义。结果：在27例病例中（22例存活，5例死亡；23例HPV阳性，2例HPV阴性，2例未知），PREX1蛋白表达被确定为排名最高的差异表达候选蛋白（p = 4.29 × 10^?5，q = 8.70 × 10^?3）。Kaplan–Meier分析显示，PREX1蛋白水平高的患者总生存期更优。DNA甲基化分析确定了8个差异甲基化基因（p, q < 0.05）；其中7个在死亡组中高甲基化（MCEMP1、RNASE2、RINL、CCL17、THBD、SFXN5、PRR19），而WDR89在存活组中高甲基化。差异甲基化启动子区的富集分析揭示了一个独特的KLF9结合调控基序（q = 0.032）。由于样本量限制（n = 2 HPV阴性，n = 2 SILVA Pattern A），针对HPV状态和SILVA模式的亚组比较仅进行描述性解释，未做推断性统计声明。结论：在这个探索性队列中，PREX1蛋白水平升高和特定免疫及代谢相关基因的启动子高甲基化与子宫颈腺癌的总生存期相关。由于目前缺乏独立的公共蛋白质组验证数据集，PREX1作为一种新的候选生物标志物，需要在更大的多中心临床队列中进行前瞻性组织学免疫组化和表观遗传学验证。

**探索性TCGA多组学队列研究揭示子宫颈腺癌中与生存相关的分子和表观遗传学改变**

子宫颈癌仍然是全球女性癌症相关发病和死亡的主要原因之一。虽然国家层面的筛查项目和预防性人乳头瘤病毒（HPV）疫苗的普及使鳞状细胞癌（SCC）的发病率显著下降，但源自子宫颈管腺上皮的子宫颈腺癌的绝对和相对发病率却呈现令人担忧的上升趋势。世界卫生组织2020年分类基于病因发病机制将子宫颈腺癌分为HPV相关型和HPV非独立型。对于HPV相关肿瘤，SILVA浸润模式系统可提供高度可重复的结构评估，以预测淋巴结转移风险并指导保留生育功能或根治性手术管理；而HPV非独立型则表现出更具侵袭性的临床特征，对常规放化疗耐药，早期远处转移倾向高，总生存率明显较差。传统解剖分期系统和标准组织学分类往往无法准确预测个体患者的临床轨迹。因此，迫切需要可靠的预后生物标志物以准确预测总生存期和无病生存期，早期识别侵袭性转移潜能，并指导精准肿瘤学策略。

该项研究旨在利用TCGA（癌症基因组图谱）多组学数据，全面表征与子宫颈腺癌总生存相关的突变、mRNA表达、蛋白表达和DNA甲基化谱。论文发表在《Current Issues in Molecular Biology》。研究人员从cBioPortal平台获取“TCGA Firehose Legacy”数据集，筛选出27例子宫颈腺癌病例，其中22例存活、5例死亡。由两位经验丰富的妇科病理学家独立评估数字化全切片图像（WSIs）上的SILVA浸润模式，并对临床结局和分子指标保持盲态。研究中比较了存活组和死亡组之间的体细胞突变、拷贝数改变（CNAs）、mRNA表达、反相蛋白阵列（RPPA）蛋白表达和DNA甲基化谱，并使用Kaplan–Meier法、log-rank检验和差异分析进行统计评估，通路和转录因子结合基序富集通过g:Profiler平台完成。结果显示，RPPA蛋白分析中PREX1是唯一具有统计学显著差异的候选蛋白，在存活患者中表达升高（p = 4.29 × 10^?5，q = 8.70 × 10^?3），且高PREX1蛋白水平与更长的总生存期相关（Log-rank p < 0.001；HR = 0.12，95% CI: 0.02–0.68）。DNA甲基化分析鉴定出8个差异甲基化基因，其中7个（MCEMP1、RNASE2、RINL、CCL17、THBD、SFXN5、PRR19）在死亡组中表现为启动子高甲基化，而WDR89在存活组中高甲基化。对差异甲基化启动子区的富集分析鉴定出一个独特的KLF9结合调控基序（q = 0.032）。

**主要关键技术与方法**
该研究基于TCGA数据库中的27例子宫颈腺癌样本队列（来源于TCGA Firehose Legacy数据集）。主要方法包括：通过cBioPortal平台进行多组学数据提取与分析；由两名妇科病理学家对全切片图像进行SILVA模式独立评估；应用RPPA检测蛋白表达，并采用基于中位绝对偏差（MAD）的高变异筛选流程；使用Seaborn和Matplotlib绘制热图；采用g:Profiler进行通路和转录因子结合基序富集分析；运用Kaplan–Meier法、log-rank检验、Cox比例风险回归以及Benjamini–Hochberg错误发现率（FDR）校正进行统计分析。

**研究结果**

**病例队列与基线特征**
研究共纳入27例子宫颈腺癌病例，存活组22例，死亡组5例。平均年龄43.2岁；FIGO分期：I期18例，II期4例，III/IV期5例；HPV状态：23例阳性，2例阴性，2例未知；SILVA模式分配：A型2例（7.4%），B型13例（48.1%），C型12例（44.4%）。由于A型和HPV阴性组的样本量极小，相关亚组比较仅作描述性分析，未进行推断性统计。

**体细胞突变、mRNA表达和拷贝数改变**
比较存活组与死亡组的体细胞突变谱、mRNA表达水平和拷贝数改变，差异均无统计学意义（p > 0.05）。这一结果表明，本队列中生存相关的分子差异可能更多源于蛋白水平和表观遗传学改变，而非结构性基因组拷贝数变化。

**RPPA蛋白表达分析**
在评估的RPPA蛋白靶标中，PREX1蛋白水平在存活患者中显著高于死亡患者（p = 4.288 × 10^?5，q = 8.704 × 10^?3）。Kaplan–Meier生存分析证实，高于中位PREX1蛋白表达的患者总生存期显著更长（Log-rank p < 0.001；HR = 0.12，95% CI: 0.02–0.68）。描述性亚组分析显示，SILVA C型肿瘤（vs. B型）和HPV阳性肿瘤中PREX1蛋白水平有升高趋势，但差异未达统计学显著性（p = 0.0696，q = 0.503；p = 0.314，q = 0.603），需谨慎解读。

**DNA甲基化分析**
差异甲基化分析共鉴定出8个在存活组与死亡组之间显著改变的基因（p, q < 0.05）。其中，MCEMP1、SFXN5、PRR19、RNASE2、RINL、THBD和CCL17在死亡患者中呈现明显的启动子高甲基化，而WDR89在存活组中高甲基化。单样本热图显示了两种结局组之间明显的表观遗传学分离模式。

**KLF9基序富集**
将差异甲基化基因进行g:Profiler富集分析后，仅识别到一个显著富集的调控基序，对应于KLF9的候选结合特征（TF:M12573；调整后p = 3.21 × 10^?2）。进一步分析发现，KLF9 mRNA表达水平与总生存期无显著关联（p = 0.427），提示该基序仅为计算预测的启动子结合信号，而非活跃的转录驱动因素，需后续功能验证。

**讨论与结论**
该研究在子宫颈腺癌中鉴定出PREX1作为唯一与生存状态相关的差异表达蛋白，并发现了多个生存相关的DNA甲基化改变及一个KLF9相关调控基序。PREX1编码磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸依赖性Rac鸟嘌呤核苷酸交换因子（Rac-GEF），调控Rac信号、细胞骨架重塑、细胞迁移和粘附。尽管PREX1在乳腺癌、前列腺癌等多种恶性肿瘤中通常与肿瘤进展和转移相关，但其预后意义具有高度背景依赖性。在本研究中，存活组患者PREX1蛋白表达更高，这一看似矛盾的结果可能反映了PREX1在子宫颈腺癌中具有环境依赖性的肿瘤抑制或稳态作用，也可能与细胞内转运、微环境免疫串扰或翻译后修饰有关。由于缺乏独立的公共蛋白质组验证数据集，该发现必须视为候选生物标志物。此外，KLF9作为Krüppel样因子家族的锌指转录因子，在子宫内膜癌等妇科肿瘤中可能发挥抑癌作用，但本队列中KLF9 mRNA与生存无关，提示其角色需进一步通过ChIP-seq和荧光素酶报告实验等功能验证。研究局限性包括样本量小（n = 27）、生存组间数量不平衡、HPV阴性和SILVA A型亚组样本极少、缺乏外部蛋白质组验证以及未进行湿实验功能验证。因此，这些发现应严格视为探索性和假设生成性的，未来需要在更大规模的多中心组织队列中进行前瞻性组织学免疫组化和表观遗传学验证。