通过靶向IL-21/IL-17轴逆转CCR9+调节性T细胞功能障碍改善1型糖尿病

《Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity》：Reversing Dysfunction of CCR9+ Regulatory T Cells by Targeting the IL-21/IL-17 Axis Improves Type 1 Diabetes

　　

目的：表达肠道归巢受体CCR9的调节性T细胞（CCR9⁺ Tregs）在1型糖尿病（T1DM）中的功能状态尚不清楚。本研究旨在探讨T1DM模型中CCR9⁺ Tregs的功能改变，并评估靶向IL-21/IL-17轴对其功能障碍的干预效果。方法：采用自发性T1DM非肥胖糖尿病（NOD）小鼠模型。通过流式细胞术从脾脏中分选CCR9⁺和CCR9^? Treg亚群。检测其对效应T细胞（Teff）增殖的体外抑制能力，并使用流式细胞术和qPCR分析细胞因子表达。体外实验中，研究人员用不同浓度（50和100 ng/mL）的抗IL-21单克隆抗体（Avizakimab）处理CCR9⁺ Tregs，以评估其对IL-21/IL-17A分泌和免疫抑制功能的影响。体内实验中，T1DM NOD小鼠被随机分为生理盐水对照组（n=3）和Avizakimab治疗组（n=3，10 mg/kg，尾静脉注射，隔日一次，持续2周）。监测空腹血糖水平，通过H&E染色评估胰岛炎和病理损伤，并通过流式细胞术分析外周血IL-17A⁺细胞的比例。结果：与CCR9^? Tregs相比，CCR9⁺ Tregs抑制Teff增殖的能力显著降低，分泌的抗炎细胞因子IL-10减少，而促炎细胞因子IL-17A和IL-21的表达显著上调。Avizakimab在体外能以剂量依赖性方式有效抑制CCR9⁺ Tregs异常分泌IL-21和IL-17A，并恢复其对Teff增殖的抑制功能。在体内，Avizakimab治疗显著降低了T1DM NOD小鼠的空腹血糖水平，减轻了胰岛炎和病理损伤，并下调了外周血中IL-17A⁺细胞的比例。结论：在T1DM微环境中，CCR9⁺ Tregs出现功能障碍并向促炎表型转变，从而加剧自身免疫反应。抗IL-21单克隆抗体Avizakimab可通过抑制IL-21/IL-17轴逆转CCR9⁺ Tregs的功能障碍并改善疾病症状，为T1DM的免疫治疗提供了新的潜在策略，并凸显了靶向该轴的转化潜力。关键词：1型糖尿病；C-C趋化因子受体9；调节性T细胞；白细胞介素-21；白细胞介素-17A

论文解读：靶向IL-21/IL-17轴逆转CCR9⁺调节性T细胞功能障碍改善1型糖尿病

**一、研究背景与科学问题**

1型糖尿病（Type 1 Diabetes Mellitus, T1DM）是一种由免疫系统异常介导的慢性自身免疫性疾病，其核心病理机制涉及自身CD8⁺ T细胞的异常激活以及B细胞产生多种胰岛β细胞自身抗体。这些自身抗体不仅直接参与破坏，还通过抗原呈递等过程协同并放大T细胞攻击。此外，辅助性T细胞（如Th1、Th17）与调节性T细胞（regulatory T cells, Treg）之间的免疫调节失衡加剧了胰腺局部炎症环境，最终导致胰岛素分泌的绝对缺乏。其中，Treg分化失衡和功能缺陷被认为是自身免疫过程启动和维持的关键因素。近年研究发现，在T1DM患者外周血中，不仅总Treg数量相对减少，还出现Treg亚群组成的异常重塑：Th1样Treg频率显著降低，Th17样Treg与Th17细胞的比例失调，提示在炎症微环境下Treg失去原有的稳态调节能力，表现出向促炎表型转变的“可塑性缺陷”。由于Foxp3表达不稳定或自身反应性T细胞异常产生促炎细胞因子，Treg常表现出效力降低。这种功能不稳定和表型转化的倾向不仅损害免疫耐受的维持，还可能加速胰腺局部自身免疫反应向致病方向演变。

近年来，表达肠道归巢受体CCR9的免疫细胞在T1DM中的作用受到广泛关注。根据功能差异，CCR9⁺细胞主要分为两类：一类是具有保护作用的CCR9⁺调节性T细胞，另一类是致病性的CCR9⁺效应T细胞。后者可共表达炎症细胞因子白细胞介素-21（interleukin-21, IL-21），并借助其表面的CCR9受体从肠道异常迁移至胰腺。在胰腺中，它们分泌大量IL-21，强烈促进细胞毒性T细胞的激活和增殖，直接加剧对胰岛β细胞的攻击。动物研究表明，清除或抑制这些致病性CCR9⁺细胞可有效预防易感小鼠糖尿病的发生。细胞因子网络的失调在这一过程中起关键驱动作用。越来越多的证据表明，IL-21不仅对CCR9⁺效应T细胞的致病功能至关重要，而且在维持Treg稳定性方面发挥着复杂且矛盾的作用。IL-21促进CD4⁺ T细胞向Th17细胞分化，增强的Th17型免疫应答已被证明可加速NOD小鼠糖尿病的发展，而中和IL-17则发挥保护作用。此外，IL-21本身可抑制Treg的诱导和功能维持；在缺乏IL-21信号的情况下，可观察到Treg相关免疫应答的相对增强。目前，靶向IL-21/IL-17信号轴的免疫调节策略正在积极探索中，包括Avizakimab在内的抗IL-21单克隆抗体已进入多种自身免疫疾病的早期临床试验。然而，在T1DM病理背景下，CCR9⁺ Tregs是否也会发生向Th17样促炎表型的功能转化，IL-21/IL-17轴在此动态过程中发挥何种具体作用，仍知之甚少。

基于此，研究人员提出科学假说：在T1DM慢性炎症微环境下，CCR9⁺ Tregs的免疫调节功能可能发生异常转化，抗炎能力下降，并异常共分泌促炎细胞因子IL-21和IL-17，将原本具有保护作用的细胞亚群转变为潜在致病性亚群；靶向IL-21/IL-17轴可能逆转这一功能障碍并改善疾病进展。为验证该假说，研究人员采用自发性T1DM NOD小鼠模型，通过体内外实验系统研究IL-17和IL-21对CCR9⁺调节性T细胞免疫功能的影响，旨在深入分析CCR9⁺细胞亚群的功能异质性，并评估抗IL-21单克隆抗体Avizakimab对该亚群的调控作用。

**二、主要关键技术方法**

本研究采用自发性T1DM非肥胖糖尿病（non-obese diabetic, NOD）小鼠作为临床前动物模型（实验动物生产许可证号SCXK（浙江）2024-0001，实验动物设施使用许可证号SYXK（浙江）2022-0015，经嘉兴市第一医院实验动物伦理委员会批准，批准号JXYY2024-031）。主要技术方法包括：（1）密度梯度离心法分离外周血单个核细胞，制备脾脏单细胞悬液；（2）流式细胞术分选CD4⁺CD25^?CD127⁺效应T细胞（effector T cells, Teff）及CD4⁺CD25⁺CD127^dim调节性T细胞，并进一步分选CCR9⁺ Tregs与CCR9^? Tregs亚群；（3）CFSE稀释法检测Tregs对Teff增殖的免疫抑制率；（4）流式细胞术和实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测细胞因子IL-21、IL-17A和IL-10的表达水平；（5）T1DM NOD小鼠尾静脉注射Avizakimab（10 mg/kg，隔日一次，持续2周）进行体内干预；（6）H&E染色评估胰腺胰岛炎和病理损伤程度；（7）空腹血糖动态监测。

**三、研究结果**

**1. CCR9⁺ Tregs的免疫调节功能显著下调**

研究人员将CCR9^? Tregs和CCR9⁺ Tregs分别与CD4⁺CD25^? Teff细胞共培养。流式细胞术CFSE结果显示，CCR9⁺ Tregs共培养组对Teff细胞的抑制率显著低于CCR9^? Tregs共培养组（P<0.0001）。这表明在T1DM环境下，CCR9⁺ Tregs抑制效应T细胞增殖的能力明显受损。

**2. CCR9⁺ Tregs组IL-17A表达显著上调，IL-10表达显著下调**

将CCR9^? Tregs和CCR9⁺ Tregs分别与CD4⁺CD25^? Teff细胞共培养后，流式细胞术结果显示，CCR9⁺ Tregs共培养组IL-17A表达显著上调（P<0.0001），而抗炎细胞因子IL-10表达显著下调（P<0.0001）。这提示CCR9⁺ Tregs在T1DM中呈现出向促炎表型转化的特征。

**3. Avizakimab显著下调CCR9⁺ Tregs中IL-21和IL-17A的表达**

与CCR9^? Tregs相比，流式细胞术和PCR检测均显示CCR9⁺ Tregs中IL-21和IL-17A的表达显著上调。加入Avizakimab（50 ng/mL和100 ng/mL）后，IL-21和IL-17A的表达均被显著抑制，且100 ng/mL浓度的Avizakimab下调效果更为明显。不同浓度组间比较均具有统计学显著性差异。该结果证实Avizakimab能以剂量依赖性方式有效抑制CCR9⁺ Tregs异常促炎因子的分泌。

**4. Avizakimab逆转CCR9⁺ Tregs的免疫抑制效应**

在CD4⁺CD25^? Teffs与CCR9⁺ Tregs的共培养体系中加入Avizakimab后，流式细胞术CFSE结果显示，50 ng/mL和100 ng/mL Avizakimab处理组的Teff增殖显著降低，且100 ng/mL浓度组的逆转效果更强。这表明Avizakimab在体外能够有效恢复CCR9⁺ Tregs对效应T细胞增殖的抑制功能。

**5. Avizakimab通过逆转胰腺组织炎症显著改善T1DM小鼠血糖水平**

与V-1组（健康对照+生理盐水）相比，V-2组（T1DM+生理盐水）小鼠空腹血糖水平显著升高；与V-2组相比，V-3组（T1DM+Avizakimab 10 mg/kg）小鼠空腹血糖水平显著下降。H&E染色结果显示，V-2组小鼠胰腺结构紊乱，胰岛形态不清，胰岛细胞数量减少，胰岛面积显著缩小；Avizakimab干预后胰腺组织炎症明显逆转。病理评分统计同样证实V-3组较V-2组显著改善。

**6. Avizakimab显著抑制CCR9⁺ Tregs中IL-17A的表达**

流式细胞术和PCR实验结果表明，与V-1组相比，V-2组外周血中IL-17A⁺细胞的表达显著增加；V-3组经Avizakimab干预后，小鼠外周血中IL-17A⁺的表达显著下降（P<0.0001）。这表明Avizakimab在体内同样能有效抑制CCR9⁺ Tregs的促炎表型。

**四、讨论总结与结论**

本研究揭示了T1DM模型中肠道归巢CCR9⁺调节性T细胞深刻的 functional 失调：其免疫抑制功能显著下调，伴随IL-17A上调及IL-10下调，导致向促炎表型转化，加剧胰岛自身免疫损伤。值得注意的是，靶向IL-21的单克隆抗体Avizakimab能有效抑制CCR9⁺ Tregs中异常升高的IL-21和IL-17A表达，并在体内外以剂量依赖性方式恢复其免疫抑制功能，最终逆转胰腺炎症并改善血糖水平。该发现提示Avizakimab通过双重抑制IL-21/IL-17轴，可能成为纠正CCR9⁺ Treg功能以治疗T1DM的新策略。

机制上，本研究阐明了一条CCR9信号在T1DM中独特的致病通路：不同于其在炎症性肠病中通过与多巴胺受体DRD5形成复合物驱动CD4⁺ T细胞迁移的作用，在T1DM中，CCR9⁺ Tregs异常增强IL-21和IL-17A的分泌，进而通过旁分泌机制促进CD4⁺效应T细胞增殖，直接驱动胰岛炎。Avizakimab对该通路的成功阻断为其临床转化提供了关键机制支持。然而，体外实验采用纯化细胞共培养系统，不能完全模拟体内复杂的细胞因子网络。另有可能是CCR9⁺ Tregs并未获得稳定的Th17表型，而仅处于“过渡状态”，真正的致病效应可能由其他辅助性T细胞亚群介导。此外，IL-21的上调可能部分源于Treg上IL-21受体的反馈激活而非主动分泌。未来的实验应采用单细胞RNA测序、蛋白转运抑制剂阻断实验和谱系示踪研究（如Foxp3命运图谱）来验证Treg的稳定性。

Avizakimab是一种人源化抗IL-21单克隆抗体，已在多种自身免疫疾病的早期临床试验中显示出良好的安全性和初步疗效。在T1DM领域，一项针对新诊断T1DM患者的II期临床试验评估了另一种IL-21阻断剂联合利拉鲁肽的方案，发现该方案延缓了β细胞功能下降；但IL-21阻断单独使用的疗效仍有待验证。本研究提供的临床前证据表明，Avizakimab可能通过恢复CCR9⁺ Tregs的功能发挥更特异的治疗作用。然而，上述临床试验中的IL-21单克隆抗体并未完全阻止疾病进展，提示单用IL-21抑制可能不足以治愈T1DM，联合免疫调节策略或许更为可取。因此，本研究发现转化意义应被解读为“为联合治疗提供新靶点”，而非独立的单一疗法。

研究结论：本研究初步证明，在T1DM病理微环境中，CCR9⁺调节性T细胞表现出免疫抑制功能降低，并向以IL-21和IL-17A表达升高为特征的促炎表型转变。此外，使用抗IL-21单克隆抗体Avizakimab靶向IL-21/IL-17轴可在体外逆转CCR9⁺ Tregs的功能缺陷，并在体内改善NOD小鼠的血糖水平和胰腺炎症。这些发现为理解CCR9⁺ Tregs的功能异质性及其在T1DM免疫失衡中的作用提供了新的实验证据，并为靶向IL-21/IL-17信号通路的免疫治疗策略提供了初步的临床前支持。本研究存在一定局限性，包括样本量小、缺乏Avizakimab的长期疗效和安全性评估，以及CCR9⁺ Tregs表型转化的分子机制（如Foxp3稳定性和CD127等表面标志物的变化）尚未阐明。因此，当前结论应被视为初步发现而非治疗有效性的确定证据。未来需要更大规模动物队列、长期疗效评估和机制研究来验证这些结果，为T1DM的精准免疫治疗奠定更坚实的基础。