一种患者来源的胃癌类器官与外周血单个核细胞的免疫激活共培养模型，用于个性化化疗筛选

《Acta Biomaterialia》：An Immune-Activated Co-culture Model of Patient-Derived Gastric Cancer Organoids and Peripheral Blood Mononuclear Cells for Personalized Chemotherapy Screening

　　

摘要

免疫治疗后选择有效的化疗方案仍然是晚期胃癌面临的主要临床挑战，因为患者反应存在高度异质性。一个主要障碍在于缺乏能够真实模拟免疫治疗后的免疫激活肿瘤微环境（TME）、同时保留免疫-肿瘤相互作用以评估后续化疗反应的个人化临床前模型。在此，我们开发了一种免疫激活共培养模型，由患者来源的胃癌类器官和自体外周血单个核细胞（PBMCs）组成。免疫激活通过使用负载抗PD-1的金色笼状纳米颗粒（aPD-1@Au NCs）实现，该策略将近红外触发的光热肿瘤消融与持续的抗PD-1介导的免疫调节相结合。所得模型再现了免疫治疗后TME的关键特征，包括免疫细胞浸润增强、肿瘤细胞凋亡增加以及CD8+ T细胞激活。我们随后利用该模型评估了五种临床相关的化疗药物，包括奥沙利铂、伊立替康、氟尿嘧啶、多柔比星和紫杉醇，用于免疫治疗后的个人化化疗筛选。与单培养类器官或非激活共培养相比，免疫激活模型揭示了药物特异性差异，包括肿瘤杀伤效果、免疫介导的化疗增敏以及PBMC毒性。在所测试的药物中，奥沙利铂表现出最强的免疫介导化疗增敏效果，而紫杉醇在相对较低的免疫毒性下实现了良好的肿瘤细胞杀伤。这些发现表明免疫激活后的化疗反应具有高度药物特异性，凸显了免疫治疗后选择个人化化疗的重要性。作为概念验证研究，本工作建立了一个部分再现免疫治疗后TME的免疫激活患者来源胃癌类器官-PBMC共培养模型，为开发免疫治疗后的个人化化疗筛选策略提供了有前景的框架。

意义声明

免疫治疗后选择有效的化疗方案仍然是晚期胃癌面临的主要挑战，原因在于患者间存在显著异质性。个人化治疗的进展受到缺乏能够真实模拟免疫治疗后肿瘤微环境（TME）的临床前模型的制约。在此，我们开发了一种免疫激活共培养模型，将患者来源的胃癌类器官与自体外周血单个核细胞（PBMCs）整合。免疫激活通过使用负载抗PD-1的金色笼状纳米颗粒（aPD-1@Au NCs）实现，该策略将近红外触发的光热肿瘤消融与持续的抗PD-1介导的免疫调节相结合。该平台在保留患者特异性肿瘤特征的同时，捕捉了免疫治疗后关键的免疫-肿瘤相互作用。利用该模型，我们评估了五种临床相关的化疗药物，并确定了在肿瘤杀伤效果、免疫介导的化疗增敏和免疫毒性方面不同的药物特异性差异。作为概念验证研究，本工作为免疫治疗后的个人化化疗筛选建立了一个有前景的框架，并支持胃癌精准治疗策略的开发。

引言

免疫治疗，如免疫检查点抑制剂（ICIs），已经彻底改变了多种晚期癌症的治疗格局，为部分患者提供了持久的临床获益[1]。然而，不同癌症类型及个体之间的反应率差异显著，这推动了探索联合策略以提高总体疗效[2]。目前提高免疫治疗疗效的策略主要集中在联合方法上，如化疗-免疫治疗和光热-免疫治疗，旨在通过同时或协调治疗增强抗肿瘤免疫反应[[3], [4], [5]]。

然而，即使采用这种增强的免疫治疗，往往仍无法实现肿瘤的完全清除，残余肿瘤细胞可能在免疫重塑的肿瘤微环境（TME）中持续存在。许多患者随后需要化疗以消除残余病灶[6]；然而，免疫治疗后的最佳化疗选择仍然在很大程度上是经验性的[7]。目前的治疗决策主要依据临床指南，而非考虑残余肿瘤细胞与激活免疫成分之间改变后相互作用的个体化模型。这一局限性不仅无法捕捉化疗敏感性的患者间变异，还忽视了化疗药物对激活免疫成分的潜在影响，从而可能损害序贯治疗策略的疗效和安全性。例如，在免疫治疗后使用指南推荐的化疗药物如卡铂，可能显著抑制CD8+ T细胞激活和IFN-γ分泌[8]。RUBY试验（III期）报告，度伐利尤单抗联合化疗组的3级或更高级别免疫相关不良事件发生率为45%，包括免疫介导的肺炎（12%）、甲状腺功能减退（9%）和结肠炎（7%）[9]。这种拮抗作用涉及复杂的机制，包括化疗直接诱导的免疫细胞毒性[10]、诱导免疫抑制微环境[11]或干扰ICI机制[12]。因此，开发个人化临床前模型以系统评估和筛选免疫治疗后的化疗方案具有重要的临床相关性和实际意义。

建立有效的体外肿瘤模型对于评估抗肿瘤药物和设计合理治疗方案至关重要。传统的二维（2D）肿瘤细胞系培养无法再现肿瘤的三维（3D）结构和细胞异质性[13]。尽管动物模型仍然是药物评估中的重要工具，但由于种间差异和伦理问题，其应用受到限制[14]。肿瘤类器官模型在保留患者肿瘤的组织学特征、遗传背景和药物敏感性方面展现出巨大潜力[14]。随着对免疫微环境在肿瘤发展、进展和治疗反应中关键作用的日益认识，开发整合免疫成分的肿瘤类器官模型已成为更准确筛选抗肿瘤药物（尤其是免疫治疗）的研究热点[15]。例如，研究人员利用去细胞化构橼生物质构建了一种包含T细胞、血管内皮细胞和巨噬细胞的胰腺癌免疫类器官模型。该模型在外层模拟基质屏障，而内层包含肿瘤和免疫细胞，成功再现了胰腺癌的免疫抑制微环境。利用该模型发现，PD-1抑制剂与表观遗传抑制剂ITF2357联合可将MHC-I表达上调3.2倍[16]。

然而，目前缺乏能够提供免疫治疗后续化疗筛选科学依据的免疫激活肿瘤免疫微环境类器官模型。虽然天然TME是免疫抑制的（"冷"），但成功的免疫治疗会将该环境转变为免疫激活的（"热"）状态，其特征是细胞毒性T细胞的恢复和促炎信号。模拟这种免疫后状态具有临床重要性，因为患者经常接受后续化疗以消除残余病灶。然而，使用传统免疫抑制模型，化疗药物对这些激活免疫细胞的影响仍未得到充分表征。因此，免疫激活共培养平台能够在保留抗肿瘤免疫的同时最大化肿瘤细胞杀伤能力，从而合理选择免疫治疗后续化疗方案。在此背景下，当前肿瘤类器官面临根本性挑战，因为它们难以稳定可靠地再现免疫治疗诱导的激活免疫微环境，如细胞毒性T细胞的激活和扩增或耗竭，以及免疫抑制细胞表型转换[17]。这种关键的"激活免疫微环境"缺失限制了它们准确预测免疫后TME中序贯化疗疗效的能力，特别是关于化疗对激活免疫细胞的潜在抑制或细胞毒性效应。虽然先前的免疫-类器官体外共培养模型已成功展示了检查点阻断治疗背景下肿瘤细胞与免疫成分之间的相互作用，但这些系统主要关注评估初始免疫反应或同步化疗-免疫治疗策略。它们未能充分再现免疫后状态，即在残余肿瘤细胞与激活免疫成分共存的情况下需要评估后续化疗反应的状态。

在本研究中，我们通过纳米材料介导的抗PD-1递送结合光热刺激产生了一种独特的范式，模拟免疫后状态（图1）。该策略通过光热诱导的免疫原性细胞死亡（ICD）诱导肿瘤免疫原性，并通过免疫检查点阻断增强抗肿瘤免疫激活，从而产生残余肿瘤细胞与恢复免疫细胞共存的环境模型。该平台能够在临床相关免疫条件下评估后续化疗疗效和免疫毒性，从而解决个性化序贯治疗优化的关键未满足需求。具体而言，我们开发了一种免疫激活的胃癌类器官模型，建立了由患者来源肿瘤类器官和自体外周血单个核细胞（PBMCs）组成的共培养系统。该模型再现了免疫治疗后的免疫环境，并允许评估化疗诱导的肿瘤细胞杀伤和潜在免疫毒性，为免疫治疗后的化疗方案个性化选择提供了平台。

方法部分

主培养

本研究已获得中山大学第七附属医院医学伦理委员会批准（批准号KY-2022-039-03），并遵循《赫尔辛基宣言》和相关中国法规要求进行。所有患者样本均经知情同意从中山大学第七附属医院获取。患者为一名66岁男性，诊断为晚期胃癌，接受了根治性胃切除术。组织学

胃癌类器官的生成

利用患者手术切除的胃组织成功建立了胃癌类器官（图2A）。如图2B所示，主培养第7天的胃癌类器官呈现典型的球形或椭球形形态，大小范围从几十微米到一百微米。插图显示这些类器官具有封闭、明确的管腔结构。传代后，类器官保持结构完整性并表现出强健的生长

讨论

免疫治疗已经从根本上改变了恶性肿瘤的治疗格局，然而大量患者最终仍需后续的细胞毒性化疗以根除残余病灶。核心挑战在于缺乏能够再现恢复的抗肿瘤免疫与后续化疗暴露之间动态相互作用的个人化临床前平台。为解决这一关键未满足需求，我们开发了一种患者来源的胃癌

结论

在本研究中，我们开发了一种新的患者来源类器官-PBMC共培养平台，整合负载抗PD-1的金色笼状纳米颗粒（aPD-1@Au NCs），建立了用于评估免疫治疗后序贯化疗的免疫激活体外模型。通过将光热肿瘤损伤与持续的抗PD-1介导的免疫调节相结合，该模型捕捉了免疫后免疫激活状态的关键特征，包括增强的细胞毒性T细胞激活和增加的

作者贡献

L.X.、T.C.和L.Y.设计并监督了研究。Y.Y.、W.C.和N.J.进行了实验研究、数据分析并撰写了手稿。C.W.、J.L.和S.Y.进行了数据分析和可视化。L.X.、T.C.、L.Y.、R.L.R.、J.M.O.和Y.H.修改了手稿。

伦理声明

所有参与者或其法定代理人已书面知情同意参与本研究并发表文章。已尊重参与者的隐私权。

本研究包含器官或组织捐献者。本研究包含人类生物材料，已获得捐献者或其直系亲属或法定代理人的同意，用于本研究及文章发表。本研究中使用的样本并非来源于被处决

数据可用性声明

支持本研究结果的数据可从通讯作者处合理请求获取。

生成式AI和AI辅助技术在手稿准备过程中的声明

在准备本工作过程中，作者使用了OpenAI的ChatGPT-5.5协助手稿的语言编辑。使用该工具后，作者根据需要审核和编辑了内容，并对已发表文章的内容承担全部责任。

利益声明

作者声明没有已知的竞争性经济利益或个人关系可能影响本论文中报告的工作。

未引用参考文献

[20,21,32,33]

补充材料

补充材料可在线或从作者处获取。

CRediT作者贡献声明

Yefan Yu：写作 - 原稿、可视化、形式分析、数据整理。Wei Chen：方法学。Ningfei Jia：形式分析、数据整理。Chen Wang：形式分析。Juan Lan：调查研究。Shuying Yan：可视化、概念化。Tiefeng Cao：资源。Yan Huang：写作 - 审阅与编辑。Rui L. Reis：写作 - 审阅与编辑。Joaquim M. Oliveira：写作 - 审阅与编辑。Leping Yan：写作 - 审阅与编辑。Lin Xiao：监督、资源、概念化。

Yefan Yu | Wei Chen | Ningfei Jia | Chen Wang | Juan Lan | Shuying Yan | Tiefeng Cao | Yan Huang | Rui L. Reis | Joaquim M. Oliveira | Leping Yan | Lin Xiao