《Genes》：The Inhibition of Histone Lysine Demethylases Affects Head and Neck Cancer Cell Growth and Response to Cisplatin
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背景/目的：头颈鳞状细胞癌（HNSCC）是一组异质性肿瘤，通常采用手术和放疗治疗，而化疗（如顺铂）、抗EGFR或免疫检查点抑制剂用于治疗局部区域晚期和复发性病例。然而，生存结果仍不理想，需要新的增效治疗方法。近期，组蛋白赖氨酸去甲基化酶（KDMs）作为有前景的
背景/目的：头颈鳞状细胞癌（HNSCC）是一组异质性肿瘤，通常采用手术和放疗治疗，而化疗（如顺铂）、抗EGFR或免疫检查点抑制剂用于治疗局部区域晚期和复发性病例。然而，生存结果仍不理想，需要新的增效治疗方法。近期，组蛋白赖氨酸去甲基化酶（KDMs）作为有前景的抗癌靶点出现。为进一步表征KDM4–6作为HNSCC中的药理学靶点，研究人员评估了HNSCC患者中KDM4/5/6表达的变化，并通过实验评估了KDM4/5/6抑制剂在HNSCC细胞系中的生物学效应。方法：研究人员使用在线工具（TIMER、GEPIA3、UALCAN）分析来自HNSCC患者的TCGA数据。随后，使用刃天青（resazurin）测定法评估ML324、GSK-J4和JIB-04（分别为KDM4、KDM6和KDM4–6的抑制剂）对FaDu、SCC-152和Detroit-562细胞在二维（2D）和三维（3D）培养中细胞活力的影响。还评估了顺铂增敏的潜力。基因/蛋白表达通过qPCR和抗体阵列进行评估。结果：研究人员发现，除KDM4C、KDM5D和KDM6A外，所分析的大多数KDMs在HNSCC中过表达。所有三种研究的抑制剂均显著降低了2D和3D细胞培养中的细胞活力。此外，用KDM抑制剂预处理细胞显示出中等的顺铂增敏潜力。并且，这些化合物显著降低了多能性标志物的表达，尤其是SOX2。结论：总之，KDM4–6抑制剂显著影响HNSCC细胞生长，并展现出与顺铂联合使用时进行表观遗传预激的潜力。
**组蛋白赖氨酸去甲基化酶4–6在头颈鳞状细胞癌中的过表达、细胞活力抑制与顺铂增敏作用——一项基于TCGA数据分析和三维培养模型的实验研究**
**1. 研究背景与目的**
头颈鳞状细胞癌（head and neck squamous cell carcinoma, HNSCC）是全球第七大常见癌症，2022年新发病例超过94万例，死亡约48万例。其发病与长期吸烟、咀嚼槟榔及饮酒等密切相关，人乳头瘤病毒（HPV）和EB病毒（EBV）感染分别与口咽癌和鼻咽癌的发生有关。目前，HNSCC的标准治疗以手术和放疗为主，化疗（顺铂、5-氟尿嘧啶、多西他赛）、抗EGFR靶向治疗（西妥昔单抗）及免疫检查点抑制剂（帕博利珠单抗、纳武利尤单抗）用于局部晚期、复发或转移性病例。然而，晚期患者的预后仍不理想，亟需开发新型增效治疗策略。
表观遗传异常在癌细胞中普遍存在，表现为DNA甲基化和组蛋白修饰谱的改变。组蛋白甲基化是可逆过程，由组蛋白甲基转移酶和组蛋白赖氨酸去甲基化酶（histone lysine demethylases, KDMs）共同调控。Jumonji C家族KDM2–8在多种癌症（包括HNSCC）的致癌过程中发挥重要作用，影响细胞信号传导、代谢重编程、增殖、凋亡、干性维持、运动能力、肿瘤微环境和免疫应答等。研究表明，调节干性潜能是KDM抑制抗肿瘤作用的关键机制之一，清除肿瘤起始干细胞样细胞可能有助于HNSCC的长期控制。既往研究显示，KDM4/5/6与包括顺铂在内的化疗药物反应相关，但针对头颈癌的证据较少。研究人员前期发现，KDM4、KDM6及KDM4–6抑制剂单用可降低HNSCC细胞活力并促进凋亡，但与顺铂同时给药未产生显著增强效果；而加入PARP1抑制剂奥拉帕利的三联组合可通过干扰DNA修复实现凋亡诱导的协同增强。近年来，“表观遗传预激”概念被提出，即先用表观遗传调节剂改变表观修饰谱，为后续药物作用创造条件。例如，胃癌细胞经DNMT抑制剂地西他滨预处理后可增强对顺铂和SN38的敏感性。基于此，本研究旨在评估：HNSCC患者中KDM4/5/6的表达变化；KDM4–6抑制剂预处理是否可增强HNSCC细胞对顺铂的反应；在更接近体内条件的三维（3D）球体培养模型中验证KDM抑制剂单用及与顺铂联合的效果；以及KDM表达与关键干性基因表达之间的关联。
**2. 主要技术方法**
研究人员利用在线生物信息学工具分析TCGA数据库中HNSCC患者（n=520）与正常对照（n=44）的KDM表达数据，包括TIMER、GEPIA3和UALCAN，用于差异表达分析、HPV状态分层分析、预后关联分析及TP53突变状态和临床分期相关性分析。实验部分使用4种HNSCC细胞系：HPV阴性的FaDu（原发下咽肿瘤）、Detroit-562（转移性咽部肿瘤）、UM-SCC-1（口底肿瘤）以及HPV阳性的SCC-152（复发性下咽肿瘤，原发部位为舌根）；细胞系分别购自ATCC和Merck。2D培养采用含5%胎牛血清的DMEM培养基，3D球体培养采用超低吸附板并在含B27和N2添加物的培养基中生长。细胞活力通过刃天青还原法评估；基因表达通过实时定量PCR（qPCR）检测；蛋白水平通过抗体阵列分析。统计分析采用Student's t检验和单因素方差分析（ANOVA）及Tukey事后检验。
**3. 研究结果**
**3.1 组蛋白赖氨酸去甲基化酶4–6在HNSCC患者中过表达**
TIMER3分析显示，KDM4A、KDM4B、KDM4D、KDM5A、KDM5B、KDM5C和KDM6B在HNSCC患者中显著过表达。KDM4A-D、KDM5A和KDM6A在HPV阳性病例中表达倾向高于HPV阴性者，而KDM5B和KDM6B呈现相反趋势。KDM4A-D和KDM5A-C的过表达在所有HNSCC病例中均可观察到，与TP53突变状态无关；KDM6A仅在无TP53突变的患者中显著过表达，KDM6B仅在存在TP53突变的患者中过表达。GEPIA3单因素分析显示，KDM4A、KDM4B和特别是KDM5D高表达与较长总生存期相关。TIMER2.0的Cox比例风险模型指出KDM5D与更好的生存显著相关，且不受HPV状态影响。多因素分析显示KDM4C高表达与较短总生存期相关，KDM5D高表达与较好预后相关。
**3.2 KDM4–6表达与干性标志物表达相关**
在全部HNSCC患者（n=520）中，除KDM5B外所有KDM亚型均与至少4个干性标志物（ALDH1A1、ABCG2、SOX2、POU5F1、NANOG）的表达呈正相关。在HPV阴性亚组（n=421）中观察到相似的关联模式；而HPV阳性亚组中正相关性较少，KDM5B与POU5F1呈负相关。实验方面，在Detroit-562细胞中，GSK-J4仅中度降低ALDH1A1的转录水平；ML324和JIB-04显著降低SOX2和ALDH1A1表达，但增加ABCG2和NANOG表达，对POU5F1无影响。抗体阵列分析显示，ML324和JIB-04处理后有降低SOX2蛋白水平的趋势，但未达统计学显著。
**3.3 KDM4–6抑制剂降低HNSCC细胞系的细胞活力**
在2D培养条件下，三种KDM抑制剂均显著降低所有受试细胞系的活力。GSK-J4在SCC-152细胞中IC50值最低（2.02 μM），10 μM浓度下完全抑制各细胞系活力。ML324同样对SCC-152细胞作用最强。JIB-04在所有细胞系中表现出最强的活力降低效力，IC50值处于亚微摩尔范围。顺铂在各细胞系中的活性存在差异，IC50值范围从SCC-152的2.25 μM到Detroit-562的7.00 μM。
**3.4 KDM4–6抑制剂部分改善顺铂介导的HNSCC细胞活力降低**
在2D模型中，FaDu细胞经JIB-04预处理后在顺铂0.75 μM和3.0 μM浓度下反应增强；ML324预处理后在顺铂1.5 μM、3.0 μM和6.0 μM浓度下增强顺铂效果。SCC-152和Detroit-562细胞仅在JIB-04预处理后于顺铂4.0 μM浓度下观察到增敏效果。
**3.5 KDM4–6抑制剂降低HNSCC球体活力**
3D球体模型所需的抑制剂浓度显著高于2D培养。GSK-J4仅在FaDu球体中可确定IC50值（32.1 μM），SCC-152和Detroit-562球体中反应在达到50%活力降低前进入平台期。ML324在FaDu球体中效力最强（IC50=12.2 μM），其次是SCC-152（IC50=24.1 μM），Detroit-562球体中约35-40%活力降低后平台化。JIB-04在FaDu（IC50=5.1 μM）和SCC-152（IC50=4.7 μM）球体中最为有效，Detroit-562球体中约35%降低后平台化。顺铂在所有三种球体中维持浓度依赖性活力降低效应，IC50值分别为SCC-152 13.8 μM、FaDu 15.5 μM、Detroit-562 30.2 μM。
**3.6 KDM4–6抑制剂预处理改善HNSCC球体中顺铂介导的细胞活力降低**
在所有受试细胞系中均观察到KDMi预处理后顺铂活性增强。GSK-J4的增敏效应大多不依赖顺铂浓度。ML324表现出与GSK-J4相似的效应谱。JIB-04的显著效果仅限于FaDu球体及SCC-152和Detroit-562的特定顺铂浓度。联合处理与任一单药相比，在大多数情况下均显示出更好的活力降低效果，仅在Detroit-562球体中使用JIB-04时未观察到。
**3.7 KDM4–6抑制剂与顺铂共处理在HNSCC球体中不如预处理有效**
FaDu球体中顺铂与KDMi共处理未较各抑制剂单药产生更强的活力降低。然而，SCC-152球体中GSK-J4或ML324与顺铂的联合在中高浓度下显著增强了活力降低，JIB-04与顺铂联合未产生额外益处。
**3.8 经长期顺铂预处理的HNSCC细胞对KDM抑制剂表现出改变的敏感性**
长期顺铂预处理（两周内给予四剂）并未明显改变细胞对顺铂本身的敏感性，但影响了其对KDMi处理的反应。2D条件下，FaDu和SCC-152细胞对JIB-04处理表现出增加的敏感性；3D条件下，仅SCC-152球体在较低浓度下对KDMi更敏感。这些结果表明KDMi可能影响顺铂持久细胞的存活。
**4. 讨论与结论**
表观遗传改变在肿瘤发生中起重要作用，阻断组蛋白甲基化谱的失调已在实验动物中显示出预防膀胱癌或前列腺肿瘤形成的能力。本研究中，除KDM5D外，KDM4-6家族大多数成员在HNSCC中过表达。KDM5D与HNSCC患者较长总生存期显著相关且不受HPV状态影响，提示其可能在HNSCC癌变中发挥独特作用。KDM5D位于Y染色体上，化学诱导的口腔癌变与Y染色体基因表达下降相关，其缺失可能通过上调白介素-17信号促进癌变。就HPV状态而言，KDM4-6抑制剂在HPV阳性和阴性细胞系中均表现出相当的活性，提示KDM抑制可能适用于HNSCC的两种亚型。
三种KDM抑制剂在2D和3D培养中均显著降低HNSCC细胞活力。JIB-04在最低浓度下表现出最强效力。3D球体培养所需的药物浓度高于2D，这与球体的药物渗透屏障和微环境差异相符。Detroit-562球体对KDMi作用相对耐药，提示不同细胞系的反应存在异质性。
KDM抑制剂调节干性基因表达是重要的抗癌机制。本研究中ML324和JIB-04降低了SOX2和ALDH1A1的表达，但诱导了ABCG2和NANOG的表达，反映了干性转录程序调控的复杂性。TCGA数据分析支持KDM表达与干性标志物之间的相关性，进一步证实干性调节在KDM抑制抗肿瘤效应中的重要作用。
表观遗传预激方面，三种KDM抑制剂均表现出一定的顺铂增敏潜力，效果具有细胞系和浓度依赖性。既往研究表明，KDM4A或KDM4C的沉默可增强卵巢癌或肝癌细胞对顺铂的敏感性，KDM5B过表达与鼻咽癌顺铂耐药相关，GSK-J4在骨肉瘤和睾丸癌细胞中增强顺铂的细胞毒作用，JIB-04通过调节同源重组DNA修复使肺癌细胞对顺铂敏感。本研究结果与这些发现一致。
长期顺铂暴露后对KDM抑制剂的敏感性改变提示，KDM4-6抑制可能对既往接受过顺铂治疗的患者具有治疗价值，但此效应不具有普遍性，仍需进一步研究建立疗效预测因子。
研究结论为：KDM4–6去甲基化酶除KDM5D外在HNSCC中表达上调，是有前景的治疗靶点。KDM4抑制剂ML324、KDM6抑制剂GSK-J4和KDM4–6抑制剂JIB-04单独应用均可显著降低2D和3D培养的HNSCC细胞活力。此外，KDMi预处理在一定程度上使HNSCC细胞对顺铂增敏。这些数据为KDM4–6抑制剂在HNSCC治疗中单独或与顺铂联合应用的可行性提供了证据。
