长期保存藻类配子体活力衰退的模式与机制解析：四十年时间维度分析

《Algal Research》：Deciphering the patterns and mechanisms of vigor decline in long-term preserved kelp gametophytes: A four-decade temporal analysis

　　

•四十年的分析揭示保藏昆布配子体活力呈非线性衰退 •长期储存诱导氧化应激并降低全基因组DNA甲基化水平 •氧化应激和DNA甲基化与生殖能力丧失密切相关 •可溶性蛋白、过氧化氢酶、T-AOC、H?O?、MDA和5-mC%被确定为活力生物标志物 •ROS-DNA甲基化-细胞命运假说解释了配子体活力衰退

引言

昆布（主要是Saccharina japonica）是全球最具经济价值的高产海藻，在食品、医药、化工产业和近岸生态恢复中发挥着重要作用[1]，[2]。精英种质是高质量产业发展的核心，种质资源的长期安全保存是育种创新的基石[3]。基于配子体能在低光照（<5 μmol photons·m?2·s?1）和低温（<4±1°C）条件下维持长期营养生长的生物学特性，建立了配子体克隆保藏技术[4]，[5]。目前中国昆布种质库中保藏的配子体克隆可追溯至1980年代，储存时间超过40年。配子体克隆技术在昆布种苗生产和遗传育种中具有巨大的应用价值[5]，支持培育了多个高产和抗逆品种，如昆布"东方7号"[6]和"E25"[7]。然而，该保藏策略的有效性面临一个关键挑战：研究表明，配子体在长期储存过程中会出现活力衰退，表现为生殖和发育能力的逐渐降低（即从营养生长向配子发生转变的能力）[8]。在严重情况下，这导致无法利用保藏的配子体进行杂交育种或种苗生产，使得保藏的种质资源实际上无法使用。因此，阐明配子体在长期保藏过程中活力衰退的模式和机制，并建立活力监测和早期预警技术，对于确保昆布种质资源的安全保存具有至关重要的意义。

昆布的生活中存在宏观孢子体和微观配子体的世代交替[9]。在不利的环境条件下，配子体会停滞其发育程序，仅进行缓慢的营养生长，形成丝状配子体克隆。当条件变得有利时，配子体可以恢复发育，完成配子形成和受精[10]，[11]，[12]。配子体从营养生长向生殖发育的转变代表其生命周期中最关键的调控节点，是种质利用的前提条件。这一转变受多种环境因素的精细调控，包括温度、光照和营养，这些因素往往表现出复杂的相互作用[10]，[11]，[12]，[13]。这些研究大大推进了我们对昆布配子体发育调控的理解，揭示了环境因素联合效应的复杂性和不同发育阶段的差异化需求。然而，这些研究主要关注调控的"方式"——具体来说，哪些外部环境条件能诱导或抑制配子发生。相比之下，调控的"机制"——即配子体细胞如何感知和转导环境信号，以及如何启动从有丝分裂向分化的细胞命运转换——仍知之甚少。在高等植物中，从细胞增殖向分化的命运转变由细胞周期调节因子（包括RBR和E2F/DP家族等）、转录因子网络和表观遗传修饰精确调控[14]，[15]。相比之下，对于昆布等褐藻，调控这一关键转换的内在分子机制在很大程度上仍是一个"黑箱"。近期的研究开始阐明昆布配子体从营养生长向生殖发育转变的生理生化和转录组水平过程：梁等人[5]报告称，在诱导发育后，活性氧信号和能量代谢途径被显著激活，Pearson等人[16]描述了宽叶昆布中转录调控和翻译后修饰相关基因的差异表达。徐等人首次在昆布中鉴定了包括Cyclin、CDK、E2F/DP和RBR在内的细胞周期相关基因，发现SjRBR在蓝光诱导的配子发生过程中表达量增加近20倍，E2F/DP基因启动子区域存在多个光响应元件，表明昆布中存在与高等植物同源的细胞周期调控系统[17]。然而，与高等陆生植物相比，昆布在这方面的研究仍极为有限。

值得注意的是，配子体活力衰退的实质正是这种细胞"分裂-分化"转换能力的丧失：储存时间较长的配子体往往维持营养生长，越来越难以被诱导进入生殖发育和配子发生。梁等人[5]表明，配子体从营养生长向生殖发育的转变伴随外部形态、亚细胞结构、生理生化特性和基因表达等多个维度的显著变化。一个关键问题有待解决：即不同储存时间的配子体克隆中观察到的明显不同的活力水平是否与这些相同维度的变化有关。在高等植物中，种子在长期储存过程中也会经历活力衰退（即种子老化）[18]。研究表明，活性氧积累引起的氧化损伤是种子老化的核心驱动因素，涉及线粒体功能障碍、膜脂质过氧化和蛋白羰基化等一系列过程，最终导致细胞死亡[19]，[20]。近年来，表观遗传调控（如DNA甲基化的变化）也被证实与种子活力的维持和衰退有关[21]，[22]。此外，海洋硅藻进入休眠阶段时会发生显著的形态重塑，包括细胞壁增厚、原生质体收缩和叶绿体重排，在水中长期休眠时仍保持代谢活跃[23]，[24]。蛋白质组学分析揭示，休眠细胞下调经典的抗氧化酶如超氧化物歧化酶和过氧化氢酶，但上调交替氧化酶以应对氧化应激，表明这是一种对长期高ROS水平的适应而非消除[24]。在代谢方面，休眠细胞经历广泛的重新编程：糖酵解和碳固定增强以维持基础能量供应，而三羧酸循环等耗能途径被抑制以节省能量；中性脂肪和多不饱和脂肪酸积累作为能量储备以支持长期生存[25]，[26]。此外，硅饥饿诱导的休眠细胞将细胞周期阻滞在G2/M期，确保细胞在不利条件下暂停分裂并将能量转向生存维持[27]。昆布配子体活力衰退的研究可以借鉴作物种子老化和硅藻休眠研究中建立的研究方法和概念框架。

基于这一背景，本研究利用昆布种质库中保藏的配子体克隆，采集年份从1981年到2020年，系统开展了以下工作：(1)评估不同储存年限配子体的配子发生率和发育率，初步揭示活力衰退的趋势和阶段特征；(2)通过形态结构、生理生化参数和DNA甲基化等多维分析，阐明活力衰退的特征和潜在机制；(3)确定适合监测配子体活力的关键指标。研究结果旨在阐明昆布配子体在长期保藏过程中活力衰退的模式和机制，从而为开发种质活力监测技术提供科学依据，确保昆布种质资源的长期安全保存。

各章节片段

昆布配子体克隆材料

本研究所用的昆布配子体克隆来自国家海洋遗传育种重点实验室（教育部）的中国海洋大学种质库。实验前，所有配子体材料均在长期低温和弱光条件下保存。具体保藏条件如下：温度4±1°C，白光照度低于5 μmol photons·m?2·s?1，光周期为

不同保藏年限昆布配子体活力衰退的模式

为阐明昆布配子体在长期保藏过程中活力衰退的模式，本研究评估了不同保藏年限（1982、1985、1997、2007、2015和2020年）配子体的卵母细胞形成率、排卵率、受精率和总发育率。关于配子体的发育进程（图1），保藏时间较短（2020年）的配子体早在第3天就开始表现出发育迹象，其特征是细胞

活力衰退的模式及其生物学意义

本研究系统评估了不同保藏年限昆布配子体的发育率和受精率，首次揭示了长期储存过程中活力衰退的模式特征。基于对在现有种质库中于低温和弱光条件下保存的历史材料的观察，我们发现配子体的发育率和受精率均表现出随着保藏时间延长而下降的趋势

结论

本研究从形态结构、生理学、生物化学等多个维度系统阐明了昆布配子体活力衰退的特征。基于对多个指标的综合分析，低温弱光条件下的种质保存过程可分为三个参考阶段：在储存的前10年内（早期衰退阶段），配子体保持相对较高

CRediT作者贡献声明

秦莹莹：撰写——原稿，方法，调查研究，数据整理。张迪：撰写——原稿，可视化，方法，调查研究，数据整理。行启坤：撰写——审稿与编辑，监督，概念化。刘福莉：撰写——审稿与编辑，项目管理，资金获取，概念化。

伦理声明

作者声明本研究不涉及人类或动物受试者。

利益冲突声明

所有作者声明不存在利益冲突，无需知情同意，也不存在涉及人类或动物权利的考虑。所有作者同意作者身份并同意提交手稿进行同行评审。

致谢

本研究获得了山东省重点研发计划（2025CXPT148、2025LZGC010）、中国农业科研系统（CARS-49）、国家重点研发计划（2024YFD2401801）和国家自然科学基金（32403012）的资金支持。

秦莹莹|张迪|行启坤|刘福莉