基于三元In?O?/ZnIn?S?/CdS异质结的APE1辅助"与"逻辑门光电化学生物传感器用于双miRNA检测

《Analytica Chimica Acta》：Ternary In 2O 3/ZnIn 2S 4/CdS heterojunction-based APE1-assisted “AND” logic gate photoelectrochemical biosensor for dual-miRNA detection

　　

摘要

光电化学生物传感已成为疾病监测和治疗跟踪的有力技术。大多数现有的光电化学平台仅能检测单一生物标志物，这限制了它们在综合疾病管理中的有效性。为了应对这一挑战，我们开发了一种新型生物传感器，该传感器将基于 DNA 的逻辑门与 In₂O₃/ZnIn₂S₄/CdS 光电极集成，用于双 miRNA 检测。理性设计的三元异质结与二元复合材料相比，表现出显著增强的光电转换性能，提供了高质量的光电传感平台。在此基础上，设计了一种具有 DNA 逻辑门和级联反应的光电化学生物传感器，其中 APE1 实现了靶标回收和 DNA 步行者移动。MiRNA-144 和 Let-7a 被认为是 2 型糖尿病的潜在诊断生物标志物，但由于其低丰度，早期临床应用受到阻碍。在引入 miRNA 后，APE1 切割发卡结构以释放链，导致 GOD 固定在电极上。随后与葡萄糖的反应增强了光电流，从而实现了 miRNA 的定量检测。得益于 APE1 辅助的级联信号放大策略，优化后的生物传感器在 0.001 nM–10 nM 范围内显示出光电流响应与双 miRNA 对数浓度之间的良好线性相关性，检测限低至 0.43 pM (S/N = 3)。此外，精心设计的 DNA 轨道实现了有序排列的传感界面，为临床诊断和疾病监测提供了广阔的可能性。

引言

微小 RNA（miRNA）是一类内源性非编码 RNA 分子，作为关键调节因子参与细胞生长、增殖和分化等多种生理过程 [[1], [2], [3], [4]]。这些分子的异常表达与多种疾病的发生和发展密切相关，使得疾病特异性 miRNA 成为诊断和预后生物标志物的理想候选者。然而，由于其特征性的低丰度，在复杂生物样本中准确表征不同的 miRNA 仍然具有挑战性。因此，开发能够实现多 miRNA 同时分析的策略对于提高疾病诊断的准确性并推进病理研究至关重要。检测 miRNA 的方法有很多，例如 RT-qPCR 和微阵列。RT-qPCR 具有强特异性和高灵敏度，但其程序复杂，易受干扰，且通量低。微阵列允许同时检测大量靶标；然而，它存在灵敏度低的问题。作为近年来新兴的分析技术，光电化学（PEC）生物传感器具有检测限低、灵敏度高、检测范围宽、响应快和成本低等优点 [[5], [6], [7], [8]]。它还表现出与 miRNA 检测的良好兼容性。但同样，PEC 生物传感器也存在许多问题，例如大多数半导体材料的光电转换效率低和光电流低。大多数仅有一种信号放大方法，无法达到 fM/pM 级的低检测限。检测靶标是单一的，并且检测信号中普遍存在假阳性问题。因此，本研究采用 PEC 生物传感器方法，并整合生物轨迹逻辑门和 DNA 步行者等生物工具，构建了一种能够同时定量和定性检测双靶标 miRNA-144 和 let-7a 的传感器 [9,10]。与其他传感器相比，本工作设计的 PEC 生物传感器实现了双靶标检测，并整合 DNA 分子逻辑电路以实现双信号放大。在提供高灵敏度的同时，它部分缓解了传统 PEC 生物传感器中普遍的假阳性问题。此外，三元异质结的构建克服了单光催化剂光电转换效率不足导致的光电流信号弱的问题，使测试结果更直观可靠 [[11], [12], [13], [14]]。

作为计算单元，逻辑门已证明其作为多目标分析和计算程序的稳健工具的有效性，为同时检测众多靶标提供了一种实用方法 [15,16]。这些逻辑门就像微型处理单元。它们接收两个或更多输入信号，运行预定义的操作，并产生输出。这使得它们成为同时检测多种 miRNA 的理想选择。核酸具有精确的沃森 - 克里克碱基配对特性、出色的生物相容性和可编程组装能力，使其适合制造分子逻辑系统。在典型的基于 DNA 的生物传感器中，各种疾病相关特征被用作输入。传感模块捕获这些特征并将其转换为可读的输出。以与门为例：只有当所有输入同时为 1 时，它才输出 1。通常，单一的癌症或疾病往往涉及多种异常表达的 miRNA，这些 miRNA 相互作用的方式可以在逻辑上反映疾病的不同阶段 [17,18]。基于这一想法，可以使用多种 miRNA 作为输入来设计合理的逻辑系统。由此产生的 DNA 分子逻辑门具有高特异性和高灵敏度。这种配置有效地抑制了假阳性信号，从而提高了早期诊断的准确性和速度。

为了实现目标 miRNA 的高灵敏检测，本研究采用了一种依靠 DNA 步行者的先进信号放大策略。作为一种创新而强大的 DNA 分子马达，得益于熵驱动耗尽效应，DNA 步行者可以沿着预设轨道自主有序移动，这赋予了它们在生物传感构建中的独特优势。这一独特特性使 DNA 步行者能够高效放大传感信号。因此，它们非常适合多种应用，包括 miRNA 检测、生物成像和分子逻辑电路构建。值得注意的是，DNA 步行者可以由‘系留介导链置换’（TMSD）或蛋白酶/DNases 驱动，从而实现信号转导和放大 [19,20]。该过程诱导 DNA 结构发生构象变化，导致分子释放或可检测信号。因此，这些智能步行者提高了生物传感的灵敏度和特异性 [21,22]。APE1 是一种广泛存在于各种人类细胞类型中的功能酶，参与 DNA 损伤修复 [23]。通过设计含有 AP 位点的合成 DNA 链，研究人员开发了利用 APE1 识别和切割这些位点的特定能力的生物传感器 [24,25]。此外，APE1 能够从双链 DNA 中高效且特异性地去除 AP 位点；因此，它被广泛用作生物传感器中的开关或驱动元件来介导信号放大。在 APE1 于识别位点切割后，其中一条单链核酸链被释放并随后与另一条链配对。利用这一特性，可以实现靶分子和扩增链的连续释放，从而促进靶标扩增和 DNA 步行者的形成。

本研究提出了一种高效的信号级联放大策略，结合了 APE1 辅助的靶标回收与 APE1 驱动的 DNA 步行者移动。这种集成设计实现了对 miRNA-144 和 Let-7a 的简单、高灵敏度和高特异性检测。该 miRNA 检测方法的实际可行性已得到彻底验证，关键实验参数已得到系统优化。在条件优化后，我们全面评估了所提出检测的分析性能。同时，证明该平台能够有效识别患者和健康对照临床样本中 miRNA-144 和 Let-7a 的差异表达水平 [9,10]。预计该方法可作为 miRNA 分析的有效工具，并在临床疾病诊断和治疗中发挥重要作用。

章节片段

材料和仪器

材料和仪器描述见补充信息。

MIL-68(In) 纳米棒的合成

改进的水热法产出了 MIL-68(In) 纳米棒 [[26], [27], [28]]。具体来说，0.81 g 硝酸铟和 0.4 g 对苯二甲酸完全溶解在 10 mL N,N-二甲基甲酰胺中，并在超声搅拌下混合。将所得的均匀溶液转移到 25 mL 聚四氟乙烯密封反应釜中，然后在 100 °C 下连续加热 24 小时。冷却至室温后

双 miRNA 检测的设计原理

图 1 提供了 PEC 生物传感器操作原理的示意图，该传感器能够同时检测两个目标 miRNA。根据图 1，具有发卡结构的 H1 DNA 在加入靶标后打开并与靶标结合，暴露出 AP 位点。在 APE1 酶存在下，启动了靶标循环反应 [38,39]。生成的 L1 和 L2 可以分别打开 H2 和 H3 发卡结构，暴露出修饰的 AP 位点。切割后

结论

总之，构建了一种能够同时检测两个目标 miRNA 的新型 PEC 生物传感器。该系统使用 miRNA-144 和 Let-7a 作为与门的输入，APE1 辅助的 DNA 步行者作为高效的信号放大机制，以及 In₂O₃/ZIS/CdS 三元异质结作为光活性电极材料。APE1 辅助的信号级联放大不仅提高了检测灵敏度，还简化了实验程序。整合的

CRediT 作者贡献声明

Longfei Zhu：写作 – 初稿，方法学，调查，正式分析，概念构思。Hong Zhao：可视化，调查。Shujing Wang：可视化，数据管理。Chengxiang Li：可视化，数据管理。Liyuan Jing：调查，数据管理。Kaiyue Liu：调查。Li Xie：资源，概念构思。Shenguang Ge：写作 – 审阅与编辑，监督，资源，资金获取，概念构思。Jinghua Yu：资源，概念构思。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争财务利益或个人关系，这可能影响本文报告的工作。

致谢

本工作由 国家自然科学基金 (22274065)、山东省自然科学基金 (ZR2024MB151, ZR2026MS0119)、泰山学者工程 (tstp20240857) 和 山东省高校优秀青年创新团队 (2025KJN018)、山东省肿瘤医院协作学术创新项目 (FC005) 支持。

Longfei Zhu|Hong Zhao|Shujing Wang|Chengxiang Li|Liyuan Jing|Kaiyue Liu|Li Xie|Shenguang Ge|Jinghua Yu

交叉研究前沿研究所 (iAIR)，济南大学化学与化工学院，中国济南，250022