氧化铜-氧化锌异质结工程化的V-gCN纳米片与多脚DNAzyme步行者耦合，用于高催化活性、超灵敏无标记厄他培南电化学适配体检测

《Analytica Chimica Acta》：CuO-ZnO heterojunction-engineered V-gCN nanosheets coupled with multi-footed DNAzyme walker for highly catalytic, ultrasensitive and label-free electrochemical aptamer ertapenem assay

　　

摘要

厄他培南（ER）是一种具有重要临床价值的碳青霉烯类抗生素，越来越被认为是残留污染物，可能通过环境和食品链暴露加速抗菌药物耐药的传播。在此，我们报道了一种无标记电化学适配体传感器，通过将异质结工程化催化界面与多价DNA纳米机器放大相结合，实现了对ER的超灵敏检测。传感界面由生长在氮掺杂图伦（V-gCN）纳米片上的金纳米粒子（AuNP）修饰的CuO-ZnO异质结构成。在该架构中，V-gCN提供导电且高比表面积的支架，CuO-ZnO异质结促进界面电荷转移和电催化活性，AuNPs促进探针固定化和生物相容的信号转导。ER适配体对靶标的识别释放出发起链，触发催化发夹组装（CHA）回路，生成大量多足DNA酶行走器。在Mg²⁺存在下，行走器切割电极限域的发夹底物并释放G-四链体链，随后与血红素结合形成电活性G-四链体/血红素复合物。由此产生的H₂O₂介导的血红素催化还原在AuNPs/CuO-ZnO/V-gCN界面进一步被放大。在优化条件下，该适配体传感器实现了0.1至100 ng mL^-1的线性范围，检测限为58.99 pg mL^-1。该传感器还对青霉素（PEN）、美罗培南（MR）、伊米培南（IMI）和比阿培南（BIA）等干扰物表现出高选择性，并在加标牛奶样本中取得了97.3%至108.4%的回收率，展示了其在建立各种基于适配体的鲁棒电化学生物传感器用于灵敏抗生素残留分析方面的潜力。

引言

厄他培南（ER）是一种重要的碳青霉烯类抗生素，在临床上已被证明对于治疗由多重耐药革兰氏阴性菌引起的感染至关重要[1]，[2]，[3]，[4]。然而，其广泛使用引发了越来越多的残留污染担忧，因为ER残留来源于畜牧业、制药制造废水和医疗废物等来源，可能导致相当严重的公共卫生风险[5]，[6]，[7]。这些残留物可以通过环境基质或食品链迁移和积累，不仅导致人类直接暴露及相关毒性效应，更重要的是对环境细菌产生持续的低浓度选择性压力。这种压力显著加速了碳青霉烯类耐药基因（如blaNDM和blaKPC）的选择、进化和水平转移，从而促进难以治疗的"超级细菌"的出现和传播[8]，[9]，[10]。耐药菌的繁殖直接削弱了一线临床抗生素的疗效，对全球传染病管理构成了严重问题[11]，[12]。因此，开发灵敏可靠的ER残留检测方法对于评估其环境归趋、中断耐药性传播链以及保障临床疗效和公共卫生来说，是一项科学和实践上的必要之举。目前ER检测方法主要依赖于HPLC[13]、超高效UPLC-MS/MS[14]和胶体金免疫层析（LFIA）[15]等传统技术。虽然这些方法在准确性方面具有优势，但通常面临仪器昂贵、样品前处理繁琐、分析时间长以及现场检测适用性有限等挑战。这些限制制约了它们在复杂基质中痕量残留物监测方面的实际应用。

电化学生物传感器以其高灵敏度、快速响应、简便性和低成本等仪器特点，在抗生素残留检测方面展现出巨大潜力[16]。利用适配体作为识别元件由于适配体具有高热稳定性、易于化学修饰和低合成成本等优点，彻底改变了生物传感器的设计[17]，[18]，[19]，[20]。更重要的是，有效DNA自组装信号放大手段的引入使得各种高灵敏度生物传感器的构建成为可能。而且，基于底物介导的链置换反应（TSDR）的DNA自组装是构建纳米尺度结构和纳米器件的关键途径[21]。借助其高度的可编程性和可预测的碱基配对规则，DNA纳米技术不仅能够构建复杂的静态纳米结构，还能够设计能够执行特定任务的动态纳米机器[22]，[23]。特别是，DNA行走器受到了 considerable attention，因为它们可以模拟自然驱动蛋白沿预设轨道的方向性运动[24]，[25]，[26]。然而，传统的单足或双足行走器通常存在结合稳定性低的问题，容易从轨道上脱离，从而中断行走过程并导致信号放大效率降低[27]，[28]。相比之下，多足DNA行走器设计通过多个足之间的协同相互作用显著增强了对轨道的结合稳定性，确保高效且持续的行走[29]，[30]，[31]。更重要的是，每个功能足都可以携带一个催化单元（如DNA酶），从而实现同时切割多个底物。由于多价效应，这种设计可以大大提高信号转导和放大能力，克服单足或双足DNA行走器的局限性，为构建超灵敏生物传感方法提供了一个理想的纳米机器平台[32]，[33]。

催化纳米材料已被证明是构建高灵敏度传感界面的核心参数，因为其催化活性、电子转移效率和活性位点数量直接决定了传感性能。优异的催化材料可以加速电化学反应并促进电荷转移，从而实现超灵敏检测[34]。在这些纳米材料中，图伦（g-C₃N₄）因其优异的性能而成为理想基底，杂原子掺杂是调节其催化性能的有效策略[35]。例如，氮掺杂g-C₃N₄（V-gCN）通过掺入V原子优化了g-C₃N₄的带结构和电子分布，增加了活性位点的密度并增强了本征导电性。因此，V-gCN解决了原始g-C₃N₄固有的电子转移缓慢和电荷复合显著的问题，建立了高效的电荷转移通道，同时提高了对目标分析物的吸附能力[36]。然而，由于单一催化纳米材料的性能限制，通过协同效应整合多种组分的优势并弥补各自的不足来形成纳米复合材料可以增强整体催化性能。在本研究中，CuO-ZnO p-n异质结被原位合成并修饰在V-gCN纳米片上，以获得高催化纳米复合材料。这些异质纳米结利用不同半导体之间的带结构差异来构建内建电场，增强光生载流子的迁移和分离，抑制其复合，从而提高催化和电荷转移效率[37]，[38]。CuO-ZnO p-n异质结（以CuO作为p型半导体，ZnO作为n型半导体）显著增强了光生载流子的分离和迁移。此外，CuO-ZnO异质结中Cu²⁺/Cu⁺ 氧化还原电对可以进一步增强电催化活性。通过协同结合多足DNA酶行走器的信号放大能力，我们在此构建了一种AuNPs/CuO-ZnO/V-gCN纳米复合材料修饰电极，实现了对ER的催化、超灵敏无标记电化学检测。

在我们的设计中，适配体对ER的识别触发释放出一种发起链。该发起链随后激活催化发夹组装（CHA）回路，生成大量多足DNA酶行走器，这些行走器有效地切割电极表面预固定的信号发夹探针，释放出大量游离G-四链体。释放的G-四链体随后与血红素结合形成电活性G-四链体/血红素物种，这些物种积累在传感电极上。在H₂O₂存在下，血红素的电化学还原产生显著放大的催化电流，用于ER的超灵敏定量分析。

章节片段

CuO-ZnO/V-gCN的合成

V-gCN首先通过煅烧法合成，使用尿素（CH₄N₂O）和偏钒酸铵（NH₄VO₃）作为前驱体。简要而言，将10 g CH₄N₂O和0.1 mol % NH₄VO₃研磨15 min以均匀混合。将所得粉末小心放入氧化铝坩埚中，在炉中以400 °C煅烧2 h，然后冷却至25 °C[39]。所得浅黄色固体随后研磨得到V-gCN粉末。

对于CuO-ZnO/V-gCN的合成，将制备的V-gCN（30 mg）

ER的检测原理

图1展示了将催化CuO-ZnO/V-gCN纳米复合材料与多足DNA酶行走器及G-四链体/血红素信号放大整合用于ER电化学检测的过程。首先通过煅烧合成V-gCN纳米片，然后水热原位生长CuO-ZnO纳米异质结。将CuO-ZnO/V-gCN分散液滴涂于玻碳电极（GCE）上，并在CuO-ZnO/V-gCN上电沉积AuNPs以构建催化

结论

总之，通过整合基于多足DNA酶行走器和G-四链体/血红素体系的信号放大策略，我们成功构建了一种使用CuO-ZnO/V-gCN异质结纳米复合材料的超灵敏无标记电化学适配体传感器。由于多种信号放大机制的协同效应，该电化学传感器对ER检测表现出显著增强的灵敏度，提供了从

CRediT作者贡献声明

姜炳英：撰写——审稿与编辑、资金获取、形式分析。袁若：资源、形式分析。李大秀：撰写——审稿与编辑、方法学、形式分析。项云：撰写——审稿与编辑、项目管理、形式分析。苏春宇：撰写——原稿撰写、调查、数据整理、概念构思。李晓：撰写——审稿与编辑、资金获取、形式分析

利益冲突声明

? 作者声明不存在可能影响本文所报告工作的已知竞争性经济利益或个人关系。

致谢

本工作得到了国家自然科学基金委员会（编号：22304187和22276019）、中国博士后科学基金会博士后 fellowship 计划（资助编号：GZC20242302）和中国博士后科学基金会（资助编号：2025M774468）的支持。

苏春宇|李晓|李大秀|姜炳英|袁若|项云

重庆理工大学化工学院、药学与生物工程学院，重庆 400054，中国