《Analytical Biochemistry》：Development and Validation of a Mechanism-Based Ba/F3-hGHR Bioassay for the Potency Assessment of Recombinant Human Growth Hormone
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•我们建立了一种特定的重组人生长激素（rhGH）效力生物测定方法，使用了稳定的单克隆Ba/F3-hGHR细胞系。•这种基于机制的测定方法规避了药典Nb2-11方法的非特异性问题。•该方法根据ICH Q2(R2)指南进行了严格的验证，适用于常规的质量控制（QC）应用。•该测定方法具
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我们建立了一种特定的重组人生长激素（rhGH）效力生物测定方法，使用了稳定的单克隆Ba/F3-hGHR细胞系。
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这种基于机制的测定方法规避了药典Nb2-11方法的非特异性问题。
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该方法根据ICH Q2(R2)指南进行了严格的验证，适用于常规的质量控制（QC）应用。
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该测定方法具有定量稳定性指示能力，能够准确检测降解的rhGH。
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它为生物制药开发和批放测试提供了一个可靠且强大的工具。
引言
重组人生长激素（rhGH）是治疗生长激素缺乏症（GHD）和调节各种代谢过程所必需的重要生物制药[1][2]。作为一种生物药品，rhGH的质量一致性对患者的安全和疗效至关重要。在其质量属性中，生物效力是临床疗效的直接指标，被指定为关键质量属性（CQA），需要按照ICH Q6B等国际指南进行严格监测[3]。历史上，垂体切除大鼠的体重增加生物测定方法是金标准[4][5]。然而，这种体内分析方法不仅成本高昂且耗时，还因个体动物差异而具有高变异性，并引发了重大的伦理问题，因此不适合现代生物制药行业所需的常规质量控制和批放测试[6][7]。
目前，Nb2-11细胞增殖测定被广泛认为是药典标准[4]。尽管这种方法在行业中表现良好，但其作用机制依赖于由催乳素受体（PRLR）而非生长激素受体（GHR）介导的促乳作用[8][9]。虽然这种交叉反应通常与治疗活性相关，但它代表了一种基于非同源受体途径的替代测量方法。因此，建立一种严格反映特定hGH-GHR相互作用（促生长作用）的生物测定方法提供了一种直接的作用机制途径，从理论上讲，这对于表征hGH产品的治疗效力更为相关。此外，从实际的质量控制（QC）角度来看，Nb2-11测定方法存在操作上的挑战，例如需要特定的血清补充（如马血清）以及需要仔细调整培养基以减少背景变异性。这些技术限制，加上缺乏GHR特异性，凸显了迫切需要一种更加可靠、人性化的、依赖于GHR的生物测定方法。
为了解决这一特异性问题，人们探索了多种利用特定hGHR的策略。一种突出的方法是报告基因测定（RGAs），这些方法因其快速周转时间和高的信噪比而受到关注[10]。然而，虽然RGAs能有效测量早期信号事件（如STAT5磷酸化），但细胞增殖测定则提供了对最终生物终点的更全面测量，整合了整个信号级联过程。Ikeda等人的研究首次证明了这种hGHR介导的增殖模型的概念可行性[11]。他们表明，小鼠IL-3依赖的Ba/F3细胞可以通过基因工程表达hGHR，从而创建一个细胞存活依赖于特定hGH刺激的系统。这些开创性的工作验证了Ba/F3-hGHR模型的生物学可行性。
尽管这种模型的可行性已经得到证实，但从研究工具转变为标准化的质量控制（QC）方法的过程仍然有限。早期版本通常依赖于多克隆细胞池，这些细胞池可能会遭受长期遗传漂变，并使用比现代检测方法灵敏度较低的比色读数（如MTT）[11]。为了填补这一空白并提供一个可靠、符合法规要求的分析程序，本研究专注于Ba/F3-hGHR模型的“制药转化”。我们建立了一个稳定的单克隆细胞系以确保长期一致性，优化了一个均匀的发光检测平台以提高精度，并且最关键的是，根据ICH Q2(R2)指南进行了全面的方法验证[12]。由此产生的生物测定方法为rhGH制剂的常规质量评估提供了一种高度特异性、可靠且无需使用动物的替代方案。
部分摘录
细胞、试剂和材料
小鼠白细胞介素-3（IL-3）依赖的pro-B细胞系Ba/F3购自上海Mcellbank生物技术有限公司（中国上海）。含有重组人生长激素受体（hGHR）编码序列的哺乳动物表达载体pcDNA3.1由上海桑冈生物科技有限公司合成。重组小鼠IL-3由苏州诺普汀科学公司提供。RPMI 1640培养基、胎牛血清（FBS）和青霉素-链霉素均从市场上购买。
Ba/F3-hGHR细胞系的建立和鉴定
评估rhGH效力的一大挑战是缺乏能够准确再现其生理作用机制的特异性体外系统。为此，我们的主要目标是工程化一个稳定的、专用于此目的的细胞系，其增殖完全依赖于hGH与其同源的人类受体的相互作用。
结论
总之，本研究将Ikeda等人和Jeay等人最初提出的Ba/F3-hGHR模型的基础概念转化为了一种标准化、适用于质量控制的生物测定方法[14]。主要进展包括建立了一个稳定的单克隆细胞系以确保长期一致性，采用了一种精确的均匀发光检测格式，并进行了符合ICH Q2(R2)指南的全面验证。最重要的是，该测定方法表现出优异的稳定性指示能力。
CRediT作者贡献声明
郭晨：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿。 罗涛：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，可视化，验证，项目管理，方法学，调查，正式分析。 陆建光：资源获取，资金筹措。 冯薛：方法学，正式分析。 董远珍：项目管理，资金筹措。 冯军：资金筹措，概念构思
利益冲突声明
陆建光持有上海多米瑞生物科技有限公司的股份。
利益冲突声明
本研究得到了上海多米瑞生物科技有限公司的支持。资助者在研究设计、数据收集与分析、发表决定或手稿制备过程中没有任何作用。
致谢
本研究得到了国家药物可行性研究重点实验室、中国医药工业研究院有限公司和上海多米瑞生物科技有限公司的资助。
冯军|罗涛|郭晨|冯薛|陆建光|董远珍
