《Analytical Biochemistry》：Validation of SARS-CoV-2 neutralization assay using VSV-based pseudovirus system
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••基于假病毒VSV的SARS-CoV-2中和试验在MOI 0.25条件下进行了优化。••使用mAb BD-604对该试验进行分析验证，显示定量限（LOQ）为125 ng，线性范围为125 ng至1000 ng，变异系数（%CV）在1.92%至13.57%之间。••该系统可有
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•基于假病毒VSV的SARS-CoV-2中和试验在MOI 0.25条件下进行了优化。
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•使用mAb BD-604对该试验进行分析验证，显示定量限（LOQ）为125 ng，线性范围为125 ng至1000 ng，变异系数（%CV）在1.92%至13.57%之间。
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•该系统可有效评估针对各SARS-CoV-2毒株中和抗体的效价。
引言
严重急性呼吸道综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）于2019年12月在中国武汉首次被确认为引发非典型肺炎疫情的病原体。由于其高度传染性和感染性，该病毒迅速演变为具有显著死亡率和发病率的全球大流行疫情[1]。该大流行疫情造成的广泛影响包括数百万人死亡和全球生活质量的显著下降，进而严重影响了全球经济稳定[2]。因此，开发针对SARS-CoV-2的有效疫苗和治疗药物成为全球健康工作的当务之急[3]。
病毒中和试验已成为分析疫苗和单克隆抗体效价的重要工具。SARS-CoV-2中和试验的金标准是使用野生型（WT）SARS-CoV-2病毒，这需要生物安全三级（BSL-3）防护设施[4]。相比之下，免疫学试验可用于更安全的中和试验，因为其不涉及活病原体。然而，基于免疫学试验的中和试验缺乏与中和试验相同精度的直接定量中和抗体滴度的能力[5]。为解决野生型病毒试验相关的安全性和可及性限制，已开发了基于假病毒的中和试验。这些试验利用表达SARS-CoV-2刺突蛋白的非复制性病毒颗粒，可在BSL-2条件下安全进行。在这些体系中，中和活性通常通过测量由荧光素酶报告基因的酶活性所产生的相对光单位（RLU）来定量，该报告基因在假病毒感染宿主细胞后表达。利用水泡口炎病毒（VSV）[6]和慢病毒载体[7]、[8]成功开发SARS-CoV-2假病毒已有充分文献记载。
生物试验的分析验证，尤其是病毒中和试验，是疫苗和治疗药物开发中的重要环节。根据ICH指南，定量试验分析验证中应检测的参数包括特异性、定量限、线性、范围、准确性和精密度。在本研究中，我们使用重组单克隆抗体对基于VSV的SARS-CoV-2假病毒中和体系进行了分析验证。
各章节摘要
携带SARS-CoV-2刺突蛋白的假VSV制备
携带SARS-CoV-2刺突蛋白的假VSV在10 cm培养皿中使用LentiX-293T细胞制备。细胞铺板后一天，转染7 μg刺突蛋白表达质粒或GFP表达质粒（作为对照），转染后6小时更换培养基。孵育24小时后，以MOI 0.1用VSVΔG-luc母病毒感染转染细胞。病毒吸附在37°C条件下进行2小时，随后使用无血清培养基在
结果与讨论
首先，对中和试验体系所使用的MOI进行了优化。携带武汉毒株（野生型/wt）刺突蛋白的假VSV和假VSV GFP作为阴性对照。MOI优化范围从0.0001至4。假VSV GFP在102-103 RLU范围内呈基线信号，而假VSV刺突蛋白的RLU随MOI升高而增加（图1A）。基于信噪比，随后在中和试验中使用两个不同的MOI（0.25和0.063）
结论
基于假VSV的SARS-CoV-2中和试验体系在使用携带武汉刺突蛋白的假VSV下已在MOI 0.25条件得到优化。该试验能够特异性检测针对武汉毒株的中和抗体，定量限为125 ng mAb。由高到低mAb浓度下，通过变异系数（%CV）评估的试验精密度在1.92%至13.57%范围内。
CRediT作者贡献声明
Yoshiharu Matsuura：撰写——审阅与编辑、监督、资金获取。Chikako Ono：监督、方法学、形式化分析。Dessy Natalia：撰写——审阅与编辑、监督、资金获取。David Chen：撰写——审阅与编辑、方法学、资金获取、概念构思。Marselina Tan：撰写——审阅与编辑、监督、项目管理、方法学、资金获取。Ernawati Arifin Giri-Rachman：撰写——审阅与编辑、监督，
数据可用性
本研究期间生成的数据集未公开提供，但可在合理请求下向通讯作者获取。
利益冲突声明
? 作者声明不存在已知的竞争性经济利益或个人关系，这些情况可能影响本文所述工作的成果。
致谢
本研究由DGHERT-JSPS双边交流计划2023财年联合研究项目和印度尼西亚教育基金LPDP（代表印度尼西亚高等教育、科学与科技部）资助，在EQUITY计划下管理（合同编号：4298/B3/DT-.03-.08/2025）。
Anita Artarini|Marselina Irasonia Tan|Ernawati Arifin Giri-Rachman|Dessy Natalia|David Virya Chen|Chikako Ono|Yoshiharu Matsuura
