尿素酶（尿素酰胺水解酶；酶委员会编号EC 3.5.1.5）是一种依赖镍的金属酶，可催化尿素分解为氨和二氧化碳，这一反应在生物系统中的氮循环中起着核心作用[1,2]。在农业系统中，尿素快速转化为氨会导致大量氮通过挥发而流失，从而降低氮的利用效率，并加剧与氨排放和硝酸盐渗漏相关的环境问题[[3], [4], [5], [6]]。微生物产生的尿素酶在致病微生物中也起着重要作用[[7], [8], [9], [10]]，并通过产生氨对食品质量产生不良影响[11]。在动物营养学中，尿素酶的活性会通过胃肠道消化过程中的快速氨释放影响氮的吸收[12]。在人类健康方面，尿素酶对幽门螺杆菌在酸性胃环境中存活并定植胃部起着关键作用，这使得该酶成为抑制剂研究的重要目标[[13], [14], [15], [16], [17]]。因此，不同类别的尿素酶抑制剂仍在持续被研究，以应用于农业和生物医学领域[18]。
天然产物是尿素酶抑制剂的重要来源[9]。对它们的研究也与人们对天然、可生物降解和清洁标签食品相关替代品日益增长的兴趣相一致[[19], [20], [21]]。在天然产物中，精油（EOs）是一种化学成分多样且尚未得到充分探索的具有潜在尿素酶抑制活性的化合物来源[[22], [23], [24]]。这些复杂的混合物主要由萜类和苯丙素类化合物组成[25,26]，在食品行业中被广泛用作调味剂和抗菌剂[27]。它们的化学多样性使其成为抑制剂发现的有吸引力的目标，而其复杂性则为直接检测多组分样品中的活性成分提供了挑战。
基于TLC的生物检测方法为复杂混合物中生物活性化合物的分析提供了一种快速且低消耗的策略[28,29]。当色谱分离与酶活性检测相结合时，可以在单个色谱区域定位抑制效应，而不仅仅是测量样品的整体反应。这种效应定向的方法已成功应用于酶-抑制剂的研究，并且还可以与生物筛选直接结合[30]。将基于TLC的效应定向检测与质谱分析相结合，进一步实现了无需预先分离即可为活性区域提供结构信息[31]。因此，已经开发出了针对多种酶目标的可用于TLC生物自显色和效应定向酶检测的方法[[32], [33], [34]]。
Shi等人之前报道了一种用于检测尿素酶抑制剂的TLC生物自显色方法[35]。在该方法中，通过酚红作为pH指示剂，利用氨生成引起的pH升高来可视化尿素酶活性。尽管这种方法能够定位TLC板上的尿素酶抑制剂化合物，但该方法尚未经过分析验证。此外，基于pH的检测方法容易受到酸性化合物的干扰，可能导致假阳性抑制结果。因此，仍需要一种经过分析验证的、能够避免pH相关干扰的TLC生物自显色方法。
在这项研究中，我们描述了一种基于TLC的尿素酶抑制检测方法的开发和验证，该方法通过结合色谱分离、基于凝胶的尿素酶生物自显色、基于Berthelot的氨检测和密度计量定量来克服这些限制。该方法被应用于精油的效应定向筛选，随后通过GC–MS分析活性色谱区域，以支持其生物活性成分的鉴定。
