三倍体皱纹盘鲍的生殖潜力、四倍体诱导可行性及甾体效应（17β-雌二醇和 17α-甲基睾酮）

《Aquaculture》：Reproductive potential, feasibility of tetraploid induction, and steroid effects (17β-estradiol and 17α-methyltestosterone) in triploid Haliotis discus hannai

　　

摘要

三倍体贝类的性腺发育异常表现为性腺组织学和生理学的同步改变，但其对皱纹盘鲍（Haliotis discus hannai）繁殖能力的影响以及类固醇水平波动的 role 尚不清楚。本研究进行了三种杂交组合：二倍体对照（2 N ♀ × 2 N ♂）、三倍体对照（3 N ♀ × 2 N ♂）以及四倍体诱导（3 N ♀ × 2 N ♂ 伴减数分裂抑制）。结果表明，三倍体雌性鲍鱼产生的功能性配子数量较少，但配子直径显著增大（P < 0.05），且能够与二倍体雄性鲍鱼的精子产生后代。三倍体对照的倍性水平为2.5 N，而诱导处理主要产生4 N幼体，四倍体率为95.65%（受精后24小时）。诱导处理同时伴随畸形幼虫比例的显著升高（P < 0.001）。为进一步评估外源性类固醇对三倍体鲍鱼繁殖的影响，在繁殖季前三个月，对三倍体个体分别植入三个剂量（5、10和15 μg）的17β-雌二醇（E2）和17α-甲基睾丸酮（17MT）。类固醇植入后，三倍体个体未发生性转换。三倍体雌性中，进入含有成熟卵母细胞阶段的比例和有效配子数量均有增加。在10 μg E2组中，有效配子数量最高，为对照组的10.98倍，且该组血浆中E2和睾酮浓度显著升高（P < 0.05）。三倍体雄性中，进入生长阶段的比例和性腺实体指数（GBIn）明显升高，但在任何处理组中均未检测到具有精子形态学特征的雄性生殖细胞。这些结果表明，类固醇处理对三倍体鲍鱼性腺发育的改善效果仍然有限，不足以恢复其繁殖能力。研究结果阐明了三倍体皱纹盘鲍（H. discus hannai）的繁殖潜力、四倍体诱导的可行性以及外源性类固醇对其繁殖的影响，为建立四倍体鲍鱼育种群体提供了依据。

引言

三倍体通过染色体操作产生，通常具有生长速度快、产量高、肉质优良和繁殖力降低等特点，从而有效提升了贝类养殖的产品质量、生产效率和可持续性（Das, 2014; Jeung et al., 2016）。最实质性的成就是全三倍体牡蛎，如太平洋牡蛎（Crassostrea gigas）和东部牡蛎（Crassostrea virginica），已在众多国家和地区投入商业牡蛎养殖（Zhou and Gui, 2017; Yang et al., 2019）。全三倍体的生产是通过四倍体与正常二倍体杂交实现的，其根本依赖于稳定的四倍体育种群体（Yang et al., 2019; Wan et al., 2023）。四倍体贝类可通过两种途径诱导：（1）直接法：抑制正常二倍体受精卵的减数分裂或有丝分裂，或采用细胞融合技术。此方法最多只能产生有限数量的可育四倍体（Guo et al., 2009）。（2）间接法：用二倍体精子受精三倍体卵（3 N ♀ × 2 N ♂），在受精后阻断减数分裂（Guo and Allen, 1994a）。此方法能够在牡蛎中生产出足够数量的可育四倍体，以建立四倍体育种系（Yang et al., 2019; Liang et al., 2024）。研究表明，三倍体贝类的性腺发育迟缓程度差异很大，导致缺乏可育配子、配子数量减少或配子育性受损（Normand et al., 2008; Liu et al., 2009）。因此，实施这种间接四倍体诱导策略前，需要确认三倍体雌性的繁殖潜力以及四倍体诱导的可行性。

额外染色体组对三倍体鱼类和贝类性腺发育的影响还反映在类固醇水平的失衡上，表明三倍体性腺的异常发育可能与功能性类固醇不足有关（Xu et al., 2016; Zheng et al., 2026）。尽管贝类内源性类固醇的生物合成及其对脊椎动物类固醇激素的生物学反应存在争议（Scott, 2012, Scott, 2013），但一些研究证据表明外源性类固醇可能对贝类的繁殖调控具有潜在的积极影响，包括性分化（Zabrzanska et al., 2015）、卵黄生成（Qin et al., 2012）和性腺成熟（Wang and Croll, 2004）。在三倍体东部牡蛎（C. virginica，Quintana, 2005）中，雌性在繁殖季仅产生相对有限的成熟卵母细胞；而在异源三倍体 crucian carp（Carassius auratus，Wang et al., 2022a）中，则未能产生成熟配子。因此，研究者尝试通过施用外源性类固醇来挽救这些三倍体的繁殖能力，并确认了处理的有限疗效。

鲍鱼养殖业长期快速发展，该海产品在全世界范围内仍然备受珍视，其闭壳肌是主要的可食用部分（Gao et al., 2022）。中国作为全球主要生产者，2024年养殖鲍鱼年产量达251,897吨，其中太平洋鲍（Haliotis discus hannai）是持续养殖的品种（中国渔业局, 2025; FAO, 2025）。鲍鱼生长缓慢（约需2–3年达到上市规格）一直被认为是限制鲍鱼养殖生产力的主要因素（Arai and Okumura, 2013）。最近，通过化学方法实现了高倍数的三倍体H. discus hannai（Wang et al., 2021）。这些三倍体鲍鱼在各种养殖模式下均表现出生长和肉产量的优势（Wang et al., 2022b; Zhang et al., 2024）。在牡蛎中，一般而言，化学或物理方法诱导的三倍体的生长优势略低于杂交三倍体（四倍体与二倍体杂交）（Wadsworth et al., 2019）。例如，在香港牡蛎（Crassostrea hongkongensis）中，不同养殖地点的杂交三倍体在壳高和总重上的三倍体优势高达25.72–34.22%，而化学三倍体则始终低于20%（Qin et al., 2022）。值得注意的是，三倍体雌性H. discus hannai在繁殖季的配子数量显著减少，且三倍体性腺中的17β-雌二醇（E2）和睾酮（T）水平在停滞阶段显著降低（Wang et al., 2026）。这些发现为鲍鱼的四倍体诱导带来了障碍，但也为通过类固醇处理增强三倍体鲍鱼的繁殖表现提供了可能。因此，相较于GnRH等推测性的上游神经内分泌调节因子（其在贝类繁殖中的作用仍处于探索阶段），E2和17α-甲基睾丸酮（17MT）被优先选择（Nagasawa et al., 2015; Sukhan et al., 2021）。

因此，本研究首先通过（a）分析卵母细胞形态学、孵化指数和倍性水平，评估H. discus hannai的种间倍性杂交（3 N × 2 N）和四倍体诱导的可行性。随后进行类固醇植入实验，评估（b）雌激素E2和雄激素17MT对三倍体鲍鱼繁殖的影响，包括性腺组织学、性腺实体指数（GBIn）、有效配子数量以及性类固醇水平。

各章节片段

配子采集与四倍体诱导

三倍体和同胞二倍体H. discus hannai由中国福建省民瑞宝海洋生物技术有限公司按照Wang等（2022b）描述的方法进行三倍体诱导生产，其中三倍体通过30 mg L^?1 6-二甲基氨基嘌呤（6-DMAP）抑制第二极体的排出而产生。二倍体和三倍体的养殖条件一致。在成熟季节，选用2龄、性腺发育良好的二倍体和三倍体鲍鱼。

二倍体和三倍体卵母细胞的形态学特征

二倍体和三倍体雌性均通过人工诱导成功排卵，但三倍体雄性在排卵水中未观察到释放的精子。10尾二倍体雌性共产约2.60 × 10⁶枚卵，平均每个雌性2.60 × 10⁵枚。11尾三倍体雌性共产约7.00 × 10⁵枚卵，每尾产卵量约6.36 × 10³枚。三倍体雌性的相对繁殖力估计仅为正常二倍体的2.45%。

繁殖潜力与四倍体诱导可行性

先前的研究表明，三倍体H. discus hannai雌性的卵巢发育紊乱，导致卵泡内成熟卵母细胞数量极少（Wang et al., 2026）。本研究证明，三倍体雌性鲍鱼产生的功能性配子数量较少。三倍体雌性鲍鱼相对繁殖力的显著降低与卵母细胞发生锁定和有效配子数量减少的结果一致。卵母细胞方面的限制……

CRediT作者贡献声明

Yi Wang（王怡）：撰写—审阅与编辑、撰写—初稿、可视化、软件、资金获取、形式分析、数据整理。Shujing Chen（陈书静）：方法论、调查、数据整理。Jianpeng Zhang（张建鹏）：方法论、调查。Jie Huang（黄杰）：方法论、调查。Yang Gan（甘阳）：方法论、调查。Yexin Chen（陈耶欣）：资源。Weiwei You（尤蔚蔚）：调查、资金获取。Xuan Luo（罗萱）：撰写—审阅与编辑、验证、监督、调查。Caihuan Ke（柯彩环）：监督……

动物实验对象

本研究遵循ARRIVE（动物研究：In Vivo实验报告）指南进行。

本研究已获得厦门大学伦理委员会批准。

利益冲突声明

作者声明不存在可能影响本论文所报告工作的已知竞争性经济利益或个人关系。

致谢

本工作得到以下基金资助：国家自然科学基金（编号32403007）、福建省科技计划项目（2024N3008）、中国博士后科学基金（编号2023M742928）、中国博士后科学基金面上资助项目（编号GZC20231423）、中央农业良种基金（CARS-49）、海洋牧场国家重点实验室自主研究项目（MBL25IR06）以及海洋牧场国家重点实验室优秀博士后奖学金。我们衷心感谢……

Yi Wang（王怡）|Shujing Chen（陈书静）|Jianpeng Zhang（张建鹏）|Jie Huang（黄杰）|Yang Gan（甘阳）|Yexin Chen（陈耶欣）|Weiwei You（尤蔚蔚）|Xuan Luo（罗萱）|Caihuan Ke（柯彩环）

中国福建省厦门市361102，厦门大学海洋与地球学院，海洋牧场国家重点实验室