N-硬脂酰酪氨酸通过抑制半胱天冬酶依赖性凋亡及 PARP-1/AIF 介导的 Parthanatos 减轻缺血再灌注损伤

《Behavioural Brain Research》：N-Stearoyltyrosine Attenuates Ischemia–Reperfusion Injury by Inhibiting Caspase-Dependent Apoptosis and PARP-1/AIF–Mediated Parthanatos

　　

摘要

脑缺血-再灌注（I/R）损伤通过caspase依赖性凋亡和parthanatos（一种由多聚（ADP-核糖）聚合酶1（PARP-1）/凋亡诱导因子（AIF）介导的caspase非依赖性途径）诱导神经元死亡。同时抑制这些途径可能提供更强的神经保护作用。N-硬脂酰酪氨酸（NsTyr）是内源性大麻素花生四烯乙醇胺（AEA）的合成类似物，在多种模型中表现出神经保护效果，但其中脑动脉闭塞（MCAO）中的疗效和机制尚不清楚。本研究采用神经元氧-葡萄糖剥夺/复氧（OGD/R）和大鼠MCAO模型来评估NsTyr的神经保护作用。使用MTT法、流式细胞术、TUNEL染色和Hoechst 33342染色评估神经元活力和凋亡情况。采用Morris水迷宫评估认知损伤。通过JC-1试验和透射电子显微镜（TEM）评估线粒体功能和超微结构。通过免疫印迹法测定关键凋亡相关蛋白的表达水平。通过测定胞内NAD?和ATP水平来评估PARP-1活性。NsTyr在体外和体内模型中均显著提高了神经元存活率、减少了凋亡并改善了认知缺陷。在机制上，NsTyr维持了线粒体完整性、保持了Bcl-2/Bax平衡、抑制了细胞色素c释放和caspase-3激活，并抑制了AIF的核转位。同时，NsTyr减轻了PARP-1过度激活，维持了NAD?和ATP水平，从而抑制了parthanatos。这些发现表明，NsTyr通过维持线粒体完整性，双重抑制caspase依赖性凋亡和PARP-1/AIF介导的parthanatos，对I/R损伤提供了强大的神经保护作用，支持其作为缺血性脑卒中治疗候选药物的潜力。

引言

缺血性脑损伤导致缺血核心区域的即刻神经元损伤以及缺血半暗带的后续损伤，其特征为延迟性神经元死亡[1]。在再灌注过程中，缺血半暗带的神经元常发生延迟性程序性细胞死亡。先前的研究强调了caspase依赖性凋亡途径（CDAP）在此过程中的重要性，而近期研究发现caspase非依赖性凋亡途径（CIAP）也在延迟性神经元死亡中发挥作用[2]。Parthanatos是一种依赖于多聚（ADP-核糖）聚合酶-1（PARP-1）的细胞死亡类型，独立于caspase发生，并且需要凋亡诱导因子（AIF）的核转位。针对caspase依赖性和非依赖性两种途径的治疗策略可能显著减轻半暗带的继发性神经元损伤，这对于改善缺血性脑损伤预后至关重要[3]。

花生四烯乙醇胺（AEA）是首个被发现的内源性大麻素，通过抑制谷氨酸释放、减少自由基产生和Ca2+内流以及抑制炎症反应，在缺血性脑损伤和神经退行性疾病中表现出神经保护作用[4]。然而，AEA的快速水解、受体非选择性作用以及其他局限性阻碍了其临床应用[5]。为解决这些挑战，我们通过化学修饰非活性位点开发了一种新型AEA类似物。我们之前的研究合成了N-脂酰氨基酸，并确定了N-硬脂酰酪氨酸（NsTyr）（图1A）为一种强效的神经保护剂。NsTyr在三转基因阿尔茨海默病小鼠模型中改善了认知功能并减少了海马CA1区域的神经元凋亡[6]，并预防了慢性脑缺血引起的延长潜伏期抑制[7]。它还通过抑制脂肪酸酰胺水解酶（FAAH）活性，减少了Aβ1-40引起的神经元细胞凋亡和谷氨酸诱导的PC12细胞凋亡[8]、[9]。然而，NsTyr对神经元I/R损伤的保护作用，特别是通过同时靶向caspase依赖性凋亡和PARP-1/AIF介导的parthanatos方面的作用，尚未得到确定。

基于我们之前的发现，我们假设NsTyr可以通过维持线粒体完整性，同时抑制caspase依赖性凋亡和PARP-1/AIF介导的parthanatos，从而对I/R损伤提供神经保护。为验证这一假设，我们采用体外神经元氧-葡萄糖剥夺/复氧（OGD/R）模型和体内大鼠中脑动脉闭塞（MCAO）模型来评估NsTyr的神经保护效果并阐明其潜在的分子机制。

章节摘要

试剂与药物

NsTyr按照我们之前描述的方法在本实验室合成[10]。DMEM培养基、胎牛血清（FBS）、谷氨酰胺、青霉素和链霉素、MTT以及JC-1试剂盒购自Gibco Invitrogen（美国加利福尼亚州卡尔斯巴德）。DPQ和z-VAD-FMK购自Merck Millipore（美国马萨诸塞州比勒里卡）。其他试剂盒购自Beyotime Biotechnology（中国上海），包括Annexin V-FITC凋亡检测（C1062L）、TUNEL试验（C1098）、核提取（P0027）、线粒体提取

NsTyr以剂量依赖方式对OGD/R诱导的损伤和凋亡提供神经保护

初级皮层神经元经历2小时的OGD后进行复氧，并在不同的恢复时间间隔评估细胞活力。OGD/R诱导的神经元损伤随时间推移逐渐加重，在复氧后16-24小时检测到活力显著降低（图1B）。复氧4小时和24小时后的活力分别降至约75%和45%；因此，选择了这两个时间点进行后续实验。

NsTyr处理（0.5-10 μM）显著提高了神经元存活率

讨论

脑卒中是全球主要的死亡和长期致残原因之一，目前尚无有效的治疗方法来保护神经元免受急性缺血及后续再灌注损伤[19]、[20]。NsTyr是内源性大麻素AEA的合成类似物，与AEA具有相似的化学结构和功能特性，但由于其抵抗FAAH和其他酶降解，因此具有更好的代谢稳定性和药代动力学特性。药代动力学研究表明，NsTyr口服给药后

局限性与未来展望

本研究存在若干局限性。首先，给药是在损伤发生之前开始的；需要进一步研究以评估NsTyr在损伤后给药时的保护效果。其次，尽管10 mg/kg的剂量是根据之前的量效关系研究选择的，但本研究采用腹腔注射，并未提供将体内剂量与体外有效浓度相关联的直接药代动力学数据。在后续工作中，我们将进行

结论

本研究表明，NsTyr通过同时抑制CDAP和CIAP，对缺血/再灌注诱导的神经元损伤提供了显著的神经保护作用。通过调节Bax/Bcl-2平衡维持线粒体完整性，NsTyr限制了线粒体功能障碍、细胞色素c释放、caspase-3激活以及AIF核转位。此外，NsTyr减轻了PARP-1的过度激活，并在复氧过程中维持了胞内NAD?和ATP水平

缩写

(NsTyr)
N-硬脂酰酪氨酸
(AEA)
花生四烯乙醇胺
FAAH
脂肪酸酰胺水解酶
(OGD/R)
氧-葡萄糖剥夺后复氧
(MCAO)
中脑动脉闭塞
(Cyto c)
细胞色素c
(TEM)
透射电子显微镜
(PARP-1)
多聚[ADP-核糖]聚合酶1
(NAD+)
氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸
(PAR)
多聚（ADP-核糖）
(FBS)
胎牛血清
(DMSO)
二甲基亚砜
(FITC)
异硫氰酸荧光素
(PI)
碘化丙啶
(PMSF)
苯甲磺酰氟
(NADH)
还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸

伦理声明

本研究按照ARRIVE（动物研究：体内实验报告）指南进行。本研究获得了上海交通大学医学院附属新华医院医学伦理委员会的批准。

关于文章撰写过程中人工智能技术（包括生成式人工智能）使用的说明

作者在文章撰写过程中使用了DeepSeek来提升英文语言质量。作者对所有内容进行了审阅和修订，并对文章的最终版本承担全部责任。

未引用的参考文献

[57]

资助

本研究得到了国家自然科学基金（编号：30873057）和上海市科学技术委员会（11JC1406600）的资助。

CRediT作者贡献声明

陆阳：撰写—审阅与编辑，监督，项目管理，资金获取，概念化。杨瑞：撰写—初稿，方法论，概念化。马静：撰写—初稿，方法论。乐可佳：撰写—初稿。

利益冲突声明

作者声明不存在可能影响本文研究结果的财务利益或个人关系。

致谢

我们感谢所有参与本研究的人员。

杨瑞|马静|乐可佳|陆阳

上海交通大学医学院附属新华医院临床药学部，上海，200092，中国