《Behavioural Processes》：Anticipatory activity to a daily palatable stimulus is accelerated in free-feeding rats housed in an enriched environment
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摘要：将刚断奶的大鼠置于丰富环境（enriched environment, EE）或标准环境（standard environment, STD）中饲养60天后，研究人员评估了由每日可口食物（巧克力）诱导的非光周期预期活动（anticipatory acti
摘要：将刚断奶的大鼠置于丰富环境（enriched environment, EE）或标准环境（standard environment, STD）中饲养60天后，研究人员评估了由每日可口食物（巧克力）诱导的非光周期预期活动（anticipatory activity, AA）。在恒定光照-黑暗循环（12:12 h LD）下，于授时时间4（Zeitgeber Time 4, ZT4）每日给予巧克力，连续12天。结果显示，EE组大鼠在预期巧克力出现时表现出更早的AA起始时间（约提前1.5天），而STD组在AA出现后的活动幅度更高。时间格局分析表明，EE组在巧克力给予前60分钟开始预期活动，而STD组提前120分钟；巧克力给予后，EE组在30分钟内恢复到基线活动水平，STD组则持续活跃长达70分钟。高架十字迷宫（elevated plus-maze, EPM）和旷场实验（open field test, OFT）未发现焦虑样行为差异。巧克力暴食测试、蔗糖偏好测试及封巧克力动机测试显示，两组在奖赏偏好和动机行为上无差异。这些结果提示，环境丰富化可能通过增强学习与记忆功能，加速非光周期预期活动的建立并提高其时间精度，而非通过改变焦虑水平、奖赏偏好或动机驱动发挥作用。
研究背景与问题
昼夜节律（circadian rhythm）是生物体内部计时系统与外部环境周期同步的生物学过程，主要由下丘脑视交叉上核（suprachiasmatic nucleus, SCN）这一主振荡器所调控。除光照这一主要授时因子外，食物可获得性、体力活动等非光周期信号也能对中枢及外周振荡器产生影响。当动物在静息期被限制为单次进餐时，在食物可获得前的2-3小时会出现明显的活动增加，即为食物预期活动（food anticipatory activity, FAA），该现象具有昼夜振荡器调控的特征，且SCN损伤后依然存在，因此学界长期致力于寻找可被食物授时的振荡器。然而，此类振荡器的解剖学定位与授时机制至今尚未阐明。当给自由摄食的动物在光照期定时提供可口食物（palatable food）时，经约7天周期暴露后，动物也会在预计授时前的1-3小时表现出AA，且该行为在撤除刺激后可维持3-7天。由于这种由可口食物诱导的AA避免了限制性进食模型中饥饿与饱腹信号的干扰，已成为研究非光周期授时振荡器的理想模型。研究发现，在可口食物授时条件下，伏隔核、杏仁核、前额叶皮层等皮层-边缘系统区域可见预期性神经元激活（c-Fos免疫染色增强）和时钟蛋白的同步化，这些脑区参与奖赏、动机、情绪和学习记忆功能。由于AA的建立需要多次周期暴露经验，且撤除刺激后该行为可持续多个周期，学习与记忆过程被认为是非光周期预期节律表达的关键机制。
关于上述问题，已有大量证据表明丰富环境（enriched environment, EE）对海马依赖性空间学习与记忆、物体识别记忆和抑制性回避任务中的记忆保持均有显著增强作用。但迄今尚无研究探讨EE对非光周期、独立于SCN的AA的影响。基于此，研究人员提出两种对立假说：其一，EE增强学习与记忆机制，应使动物需要更少的暴露周期即建立AA；其二，EE动物对蔗糖、酒精、吗啡等高奖赏物质通常表现出更低的消费量，提示其可能因奖赏动机降低而需更多周期才出现AA。为分辨这两种可能性并确定AA组间差异是否可归因于刺激偏好或动机驱动差异，需要在方案结束后对奖赏刺激偏好与动机进行评估。
研究方法
研究使用Wistar雄性大鼠（Rattus norvegicus），于断奶日（PD22）至PD82期间分别饲养于标准实验室条件（STD组，n=22）或丰富环境条件（EE组，n=20）。EE笼具（120×100×70 cm）内设有四层结构和塑料球、隧道等互动元件，每三天变更空间布局以维持新奇性。在PD82通过高架十字迷宫（elevated plus-maze, EPM）和旷场实验（open field test, OFT）评估焦虑样行为。随后所有动物单笼饲养，通过笼盖上的红外探测器连续记录24小时自主活动。参照光周期节律，在PD89至PD100期间于授时时间4（Zeitgeber Time 4, ZT4）每日给予5 g巧克力条形食物，研究人员分析预期巧克力前两小时（ZT2-ZT4）在光照期每日出现的AA及其活动幅度，并于PD101-103评估AA的持续性。通过巧克力暴食测试（chocolate binge test）评估奖赏价值，通过封巧克力动机测试（motivation for enclosed chocolate test）评估探索和主动努力行为，通过蔗糖偏好测试（sucrose preference test）评估对另一种可口刺激的偏好。使用Welch's t检验和重复测量方差分析进行数据统计。
研究结果
EPM和OFT结果：在EPM中，两组在开臂停留时间和开臂进入次数上均无显著差异；OFT中，两组在中央区停留时间和中央区穿越次数上也无显著差异，表明焦虑样行为在两组间无区别。但STD组在外周区穿越次数是EE组的约两倍，提示EE组在新环境中的总体活动水平较低。
AA起始时间结果：与STD组相比，EE组AA首次出现的时间平均提前约1.5天（t=2.37, p=0.023），表明EE组的非光周期授时建立更快。
AA幅度结果：在AA出现后的六天内，STD组在ZT2-ZT4区间的活动百分比高于EE组，重复测量ANOVA显示组别主效应显著（F(1,40)=5.7, p=0.02）。时间格局分析（ZT1-ZT7窗口，每10分钟一个区段）显示，STD组在巧克力提供前120分钟即开始出现预期活动，而EE组仅在巧克力提供前60分钟才开始；巧克力提供后，EE组在30分钟（10分钟记录区间内）内即回到基线活动水平，STD组则持续至巧克力后70分钟。EE组相较于STD组在每日光照期保持活动的时间平均缩短约1.5小时。AA持续期分析显示，在撤除巧克力后三天（PD101-103），所有动物的预期活动均维持存在，两组间无显著差异。
巧克力暴食测试结果：两组在60分钟内的巧克力消耗量无显著差异，按体质量标准化后亦然，且换算为卡路里并标准化为每日能量摄入的百分比后仍无差异，表明两组对巧克力的适口性和享乐价值相似。
蔗糖偏好测试结果：在48小时的选择窗口内，两组对1%蔗糖溶液的偏好指数无显著差异，表明两组对另一种高可口刺激的偏好一致。
封巧克力动机测试结果：第一天面对空容器时，STD组的被动探索时间显著高于EE组（p<0.05），第二天面对装有巧克力的容器时，STD组的被动探索时间仍显著高于EE组（p<0.005），但两组在旨在获取巧克力的主动行为（如啃咬、推挤和用前爪操纵容器）持续时间上无显著差异，表明两组在获取先前已授时刺激的动机性努力水平相当。
讨论总结
研究发现EE可加速由每日可口刺激物诱导的预期性活动建立，且AA表达具有更高的时间精度。STD组AA幅度更高是因为其提前120分钟即开始探索巧克力，而EE组仅在刺激到达前60分钟开始预期活动；巧克力给予后STD组的活动返回基线也更晚。进一步的行为学测试排除了焦虑差异、奖赏偏好或动机驱动对结果的替代解释。研究人员提出EE可能通过增强学习记忆和促进快速适应新异情境来加速非光周期授时，并进一步指出中脑腹侧被盖区（ventral tegmental area, VTA）多巴胺能系统及其到SCN的投射可能在加速授时过程中起作用。
研究结论
本研究从断奶至成年期探究了社会性、物理性和认知性丰富饲养对非光周期授时刺激诱发的预期活动的影响。在本研究条件下，EE与巧克力预期活动的提前起始相关，而在可口刺激偏好或动机或焦虑样行为方面未检测到显著差异。EE动物还表现出更严格时间限制的预期活动模式。这些结果表明环境丰富化可能影响非光周期诱导预期活动的表达特征和时间组织，但其内在机制有待确定。
