双重识别驱动定点G-四链体稳定化：G4配体-寡核苷酸偶联物中的寡核苷酸设计

《Molecular Therapy Nucleic Acids》：Dual recognition drives site-directed G-quadruplex stabilization: Oligonucleotide design in G4 ligand-oligonucleotide conjugates

　　

G-四链体（G-quadruplex，G4）DNA结构因其在转录调控和基因组稳定性中的重要作用而日益受到关注，使其成为极具吸引力的治疗靶点。然而，由于G4基序之间存在高度结构相似性，实现对单个G4的选择性识别仍具挑战性。G4配体-寡核苷酸偶联物（G4 Ligand-Oligonucleotide conjugates，GL-Os）通过将小分子G4配体与寡核苷酸的序列特异性相结合，靶向预期G4靶点侧翼的序列，从而解决了这一难题。在本研究中，研究人员系统探究了寡核苷酸长度、骨架组成及序列互补性如何决定GL-O的结合能力、选择性和G4稳定化效应。研究表明，有效的G4识别依赖于寡核苷酸杂交与G4配体结合之间的相互依存关系，二者协同增强复合物稳定性与位点特异性。较长的寡核苷酸可促进形成更稳定的复合物并诱导更强的G4稳定化，而中央区域错配会破坏这一双重识别机制。以肽核酸（peptide nucleic acids，PNAs）替代DNA可增强结合强度、热稳定性及代谢稳定性。重要的是，配体偶联可将PNA寡核苷酸从非特异性聚合酶停滞效应重新导向为选择性G4稳定化作用。最后，研究人员证实了修饰型GL-Os可通过受体介导的细胞摄取进入细胞，这支持了细胞递送的可行性，同时也揭示了仍存在的递送障碍。综上所述，这些发现阐明了调控GL-O行为的分子设计原理，为未来开发与评估选择性G4靶向治疗策略奠定了基础。

**G4配体-寡核苷酸偶联物中寡核苷酸设计驱动的双重识别与G-四链体定点稳定化——论文解读**

**一、研究背景与意义**

G-四链体（G-quadruplex，G4）是由富含鸟嘌呤的核酸序列形成的非经典二级结构，通过Hoogsteen氢键将四个鸟嘌呤碱基组装为G-四分体（G-tetrad）平面，并在一价或二价阳离子（如Na⁺或K⁺）稳定下逐层堆叠。G4结构广泛存在于人类基因组启动子区域，直接参与转录调控，其中以MYC癌基因启动子中的Pu27序列最具代表性。小分子G4配体虽能结合并稳定G4结构从而下调MYC表达，但由于人类基因组中存在超过700，000个潜在G4位点，且多数配体以保守的G-tetrad为主要结合位点，导致普遍存在脱靶效应。因此，实现对单个G4结构的精准靶向是该领域的核心挑战。G4配体-寡核苷酸偶联物（GL-Os）策略通过将G4配体与互补于靶G4侧翼序列的寡核苷酸共价偶联，利用寡核苷酸的序列特异性引导配体精准锚定目标G4。本研究聚焦这一策略中寡核苷酸元件的分子设计，系统考察长度、骨架组成和序列互补性三个关键参数对GL-O结合特性、选择性及G4稳定化能力的影响。该研究发表在《Molecular Therapy Nucleic Acids》。

**二、主要技术方法**

研究人员综合运用多种生物物理与生化技术：利用微尺度热泳（MST）定量测定GL-O与c-MYC Pu24T G4 DNA的结合解离常数（K_D）；采用质子核磁共振（¹H-NMR）波谱检测G4亚氨基质子（10–12 ppm）和双链DNA亚氨基质子（12–14 ppm）信号，评估结构相互作用；通过温度梯度NMR熔化实验测定热稳定性；运用Taq聚合酶终止实验评估G4稳定化的功能效应；结合圆二色光谱（CD）测定熔化温度；利用Bowtie 2.0将不同长度寡核苷酸序列与人参考基因组（GRCh38）进行全基因组比对分析序列唯一性；使用绿豆核酸酶（MBN）消化实验评估代谢稳定性；通过共聚焦显微镜观察ASGR1受体介导的细胞摄取。

**三、研究结果**

**3.1 不同G4靶点潜在寡核苷酸长度的序列保守性分析**

通过将不同长度寡核苷酸序列（5–20 nt）与人参考基因组进行严格比对（不允许错配），发现所需寡核苷酸长度高度依赖具体G4靶点：c-MYC Pu27序列在14 nt时即可获得单一位点特异性，而13 nt变体额外匹配3个基因组位点但均不邻近预测G4区；相比之下，KRAS和Helicase B来源的13 nt序列分别匹配74和309个基因组位点，选择性显著较低。

**3.2 寡核苷酸修饰GL-Os的设计**

在保留前期研究确定的G4配体和连接基团基础上，通过无铜点击化学（菌株促进的叠氮-炔环加成）将叠氮功能化G4配体与5′-双环壬炔（BCN）修饰的DNA寡核苷酸偶联，合成DNA基GL-Os D6–D20（6至20 nt）。PNA基GL-Os P6–P15通过固相肽合成法在自动合成仪上制备，G4配体可直接在固相载体上通过酰胺偶联连接至PNA的N端。为探究序列互补性影响，设计了基于15 nt序列的系列三连点突变GL-Os（TM1–3至TM13–15），将连续三个碱基替换为胸腺嘧啶（原胸腺嘧啶替换为胞嘧啶以保持碱基组成）。

**3.3 寡核苷酸修饰GL-Os的结合特性**

**寡核苷酸长度的影响**：MST分析显示，短于8 nt的偶联物结合可忽略不计，确定8 nt为有效杂交的最小长度；8–16 nt范围内DNA基GL-Os D8–D16具有相当的亲和力（K_D = 15–37 nM），而D18和D20初始结合亲和力降低（K_D = 170和320 nM），但延长孵育至24 h后显著改善，表明较长寡核苷酸杂交动力学较慢。NMR谱证实，6至20 nt长度递增伴随dsDNA特征信号的出现，但超过10 nt后G4特异性亚氨基共振不再改变。

**骨架组成的影响**：PNA基GL-Os在相同长度下K_D值均低于DNA对应物，归因于PNA中性肽样骨架消除静电排斥。NMR显示PNA-GL-Os对G4亚氨基质子信号产生更显著的展宽和位移，表明更强或更持久的G4相互作用。未偶联的PNA寡核苷酸本身即可诱导G4区域微小位移，但偶联配体后扰动显著增强，说明配体与PNA协同稳定复合物。

**序列互补性的影响**：三连点突变系列显示明确的错配位置依赖性。中央区域突变（TM7–9）导致K_D值显著升高，而末端突变（TM1–3和TM13–15）影响较小。NMR证实中央错配减弱G4相互作用，而邻近G4的末端错配（TM1–3）反而增强配体效应，可能通过引入局部柔性同时维持G4相互作用所需的空间构型。

**3.4 寡核苷酸修饰GL-Os的G4稳定化作用**

**寡核苷酸长度的影响**：NMR温度梯度实验显示，DNA基GL-Os中寡核苷酸长度增加与双链熔解温度（T_m）及G4配体解离温度升高相关。GL-O D20在约65℃仍保留相互作用信号，且双链熔解与G4-配体作用丧失在相似温度发生，表明协同稳定效应。Taq聚合酶终止实验一致显示，除D6外所有DNA GL-Os均剂量依赖地增强聚合酶停滞，较长寡核苷酸（D16、D18）产生更强停滞效应，与热稳定性数据吻合。

**骨架组成的影响**：PNA基GL-Os整体表现出比DNA对应物更高的热稳定性，GL-O P15在65℃仍保留强双链和配体相关信号，而GL-O D15在约55℃即消失。但未偶联PNA寡核苷酸与偶联物具有相似的双链熔化曲线，反映PNA内在较强杂交能力及对配体结合的较低依赖性，提示需关注非特异性相互作用。在Taq聚合酶终止实验中，PNA-GL-Os在0.04 μM无活性而0.2 μM即完全抑制全长产物，呈陡峭剂量响应。重要的是，未偶联的PNA寡核苷酸（如P15）虽强烈抑制聚合酶延伸，但产生源于PNA:DNA杂交体的停滞条带而非G4稳定化；偶联G4配体后，GL-Os的抑制效应完全归因于G4稳定化而不存在PNA诱导的聚合酶停滞。CD熔化实验进一步证实，PNA寡核苷酸单独不稳定化G4，而配体偶联的PNA GL-Os产生超过单独配体的显著G4稳定化。

**序列互补性的影响**：含中央三连点突变的GL-Os（TM4–6、TM7–9、TM10–12）失去热稳定化能力，即使35℃也几乎无相互作用，而末端突变GL-Os可将G4关联维持至50℃–55℃。Taq聚合酶终止实验中，中央突变体在最高浓度仅产生约50%全长产物，与NMR熔化数据一致。

**3.5 GL-Os对核酸内切酶的稳定性**

绿豆核酸酶（MBN）消化实验显示，DNA基GL-O D15随时间逐渐降解但比未偶联oligo D15更稳定；PNA基GL-O及未偶联PNA寡核苷酸在相同孵育期内完全不被消化，表明PNA骨架赋予优异的代谢稳定性。

**3.6 DNA基GL-Os的细胞进入与定位**

将GL-O D15改造为全硫代磷酸酯（PS）骨架、3′-Cy3荧光标记和3′-三价GalNAc部分（GL-O D15-PS-Cy3-GalNAc），该修饰型GL-O在核酸酶稳定性测试中至少稳定20 min。在诱导型表达ASGR1的HEK293细胞中，未诱导时仅见少量摄取，而受体表达后摄取效率提高数倍。共聚焦显微镜显示荧光信号主要分布于细胞质并呈点状模式，符合受体介导内吞后定位于内体区室的特征；核信号有限，表明内体逃逸是实现核内G4靶向的主要限速步骤。

**四、讨论与结论**

本研究系统阐明GL-O策略中寡核苷酸元件的分子设计原则。全基因组比对分析确立选择性概念框架：序列唯一性高度依赖靶点，但双重识别机制（寡核苷酸杂交和G4配体结合的相互依存）提供内在防脱靶保障，使寡核苷酸无需全基因组绝对唯一。寡核苷酸长度发挥双重效应：过短（<8 nt）无法有效杂交，中间长度（10–16 nt）有效结合但稳定化适中，较长（≥18 nt）虽结合较慢但形成更持久的复合物并驱动更强的G4稳定化。PNA骨架替代增强结合、热稳定性和代谢稳定性，但需配体偶联将其从非特异性聚合酶阻断剂转化为选择性G4稳定剂。中央互补性对维持有效配体参与至关重要。受体介导细胞摄取的实现是重要进展，但内体逃逸和核转运仍是关键挑战，PNA基GL-Os可能因溶解性差和中性骨架需要进一步递送优化。结论指出，有效GL-O结合和G4稳定化取决于寡核苷酸杂交与配体参与间的精妙平衡，三个参数共同决定这一平衡：短序列杂交效率低，长序列结合较慢但形成复合物更稳定，中央错配破坏双链形成，而PNA替代增强结合强度但需配体偶联维持特异性。这些发现为未来合理设计靶向G4生物学研究的GL-O工具和评估其治疗潜力（尤其在c-MYC启动子等致癌情境中）奠定了基础。