槲皮素衍生碳点修饰ZIF-8与M2巨噬细胞衍生迁移体功能化的微环境响应性纳米复合水凝胶用于骨质疏松性骨缺损再生

《Bioactive Materials》：Quercetin-derived carbon dots-modified ZIF-8 and M2 macrophage-derived migrasomes-functionalized microenvironment-responsive nanocomposite hydrogel for osteoporotic bone defects regeneration

　　

骨质疏松个体的再生能力受损对骨缺损的修复构成重大挑战。在骨质疏松微环境中，低pH、过量活性氧（reactive oxygen species, ROS）和慢性炎症形成自我延续的恶性循环，阻碍愈合。然而，传统疗法无法持续改善受损的微环境。本研究开发了一种基于氧化透明质酸（oxidized hyaluronic acid, OHA）、苯硼酸接枝ε-聚赖氨酸（phenylboronic acid-grafted ε-polylysine, PP）、槲皮素衍生碳点（quercetin-derived carbon dots, QCDs）负载ZIF-8（Z-QCDs）和M2巨噬细胞衍生迁移体（M2 macrophage-derived migrasomes, M2-Migs）的pH/ROS双响应纳米复合水凝胶（Z-QCDs@M2-Migs@OHA-PP），该水凝胶具有固有的抗氧化和促成骨分化能力。由于动态席夫碱键和硼酸酯键的存在，该水凝胶表现出可注射性和pH/ROS双响应性。OHA-PP响应pH和ROS水平的变化按需释放Z-QCDs和M2-Migs。Z-QCDs表现出强抗氧化和纳米酶活性，能够清除ROS、抑制炎症反应并促进M2巨噬细胞极化。此外，引入M2-Migs作为成骨激活剂进一步增强了成骨分化能力。转录组学和蛋白质印迹分析揭示，该水凝胶通过激活PI3K-AKT信号通路促进成骨分化。在小鼠骨质疏松性骨缺损模型中，该纳米复合水凝胶有效抑制铁死亡、调节炎症并促进新骨形成。因此，这种将治疗原理与微环境调控相结合的水凝胶系统为骨质疏松性骨缺损的再生提供了一种有前景的策略。

**基于微环境调控的pH/ROS双响应纳米复合水凝胶促进骨质疏松性骨缺损再生的研究解读**

**一、研究背景与问题提出**

骨质疏松症是一种以骨量减少、骨微结构退化和骨脆性增加为特征的系统性骨代谢疾病，是老年人尤其是绝经后女性骨折和骨愈合失败的主要病理因素。与正常骨缺损相比，骨质疏松性骨缺损不仅表现为成骨能力降低、骨整合受损和新骨形成延迟，还伴随局部微环境的长期紊乱，包括氧化应激增加、持续性慢性低度炎症、骨吸收与骨形成失衡以及干细胞成骨分化潜能降低，这些因素共同限制了骨再生的效果。因此，仅依靠传统支架或单一成骨因子的递送往往难以在骨质疏松条件下获得满意的修复效果。

近年来，越来越多研究表明，治疗骨质疏松性骨缺损的关键不仅在于促进骨形成，更在于重塑病理微环境。在骨质疏松状态下，雌激素缺乏、细胞衰老和免疫失衡可导致过量ROS积累，与肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）和IL-6等炎症因子形成相互强化的恶性循环。一方面，过量ROS通过激活核因子κB（NF-κB）和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）等通路促进破骨细胞分化和骨吸收；另一方面，ROS抑制runt相关转录因子2（Runx-2）、碱性磷酸酶（ALP）和骨钙素（OCN）等成骨相关分子的表达，损害骨髓间充质干细胞（BMSCs）和成骨细胞的成骨分化能力，诱导细胞凋亡或功能衰退。此外，局部酸性微环境也是导致骨质疏松骨重塑失败的重要致病因素。过度活化的破骨细胞在吸收腔内持续分泌质子和酸性酶，形成酸化环境，该环境不仅进一步增强骨矿物质溶解和破骨活性，还损害线粒体功能、破坏骨免疫稳态并抑制成骨细胞和干细胞的成骨分化，最终形成"酸化-破骨活性增强-进一步酸化"的恶性循环。鉴于骨质疏松性骨缺损微环境具有低pH和高ROS的特征，开发能够感知并响应局部ROS和酸化的智能材料，有望在病变部位实现更精准的干预。

**二、研究内容与结论**

研究人员设计并开发了一种共载ZIF-8负载QCDs（Z-QCDs）和M2-Migs的pH/ROS双响应纳米复合水凝胶系统（Z-QCDs@M2-Migs@OHA-PP）。该系统通过清除ROS、调节炎症反应和抑制铁死亡，显著改善局部受损微环境，最终促进成骨分化和骨质疏松性骨缺损的再生。转录组学和蛋白质印迹分析揭示该水凝胶通过激活PI3K-AKT信号通路促进成骨分化。在小鼠骨质疏松性骨缺损模型中，该纳米复合水凝胶有效抑制铁死亡、调节炎症并促进新骨形成。该研究为骨质疏松性骨缺损的再生提供了一种将治疗原理与微环境调控相结合的新策略。论文发表在《Bioactive Materials》。

**三、主要关键技术方法**

研究人员主要运用了以下关键技术方法：（1）单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据分析，对来自基因表达综合数据库（GEO）的4个骨质疏松样本（GSE169396）和1个非骨质疏松样本（GSE147287）进行整合分析，使用Harmony算法校正批次效应，通过Seurat聚类识别细胞亚群；（2）水热法制备QCDs，配位自组装合成ZIF-8和Z-QCDs纳米复合材料；（3）超速离心和过滤法从IL-4诱导的RAW264.7细胞中分离纯化M2-Migs；（4）通过动态硼酸酯键和席夫碱键交联OHA和PP构建可注射水凝胶；（5）转录组测序（RNA-seq）结合基因本体论（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析及基因集富集分析（GSEA）解析信号通路；（6）双侧卵巢切除术（OVX）建立小鼠骨质疏松模型，Micro-CT和组织学染色评估体内骨再生效果。

**四、研究结果**

**4.1 单细胞转录组分析揭示ROS和铁死亡参与骨质疏松发病机制**

通过对23,883个细胞样本的整合分析，鉴定出12种细胞类型。骨质疏松组股骨头组织中免疫细胞亚群和脂肪细胞比例增加，而成骨细胞比例降低。ROS相关评分和铁死亡驱动因子评分在骨质疏松组显著升高，而铁死亡抑制因子显著下调。体内实验证实骨质疏松小鼠股骨组织中ROS水平显著升高且铁死亡被激活。

**4.2 QCDs、ZIF-8、Z-QCDs和M2-Migs的表征**

QCDs呈球形，平均粒径2.15±0.43 nm，晶格间距0.22 nm，具有类石墨烯结构。Z-QCDs粒径为152 nm，QCDs封装于ZIF-8内且无明显聚集。M2-Migs平均粒径855.1 nm，高表达N-脱乙酰酶和N-磺基转移酶1（NDST1）和四旋蛋白4（TSPAN4），弱表达细胞外囊泡标志物TSG101。

**4.3 纳米复合水凝胶的表征**

水凝胶在3秒内原位凝胶化，表现出优异的可注射性和剪切稀化行为。G′>G″确认水凝胶成功形成。低pH或高ROS刺激导致水凝胶迅速塌陷并转变为液态，pH+ROS联合刺激下网络结构破坏更为显著。水凝胶在模拟骨质疏松微环境（pH 5.0+1 mM H₂O₂）中持续降解，第14天M2-Migs释放率达92.31±7.63%。

**4.4 生物相容性评估**

活/死染色显示各组细胞活力保持完好，未观察到细胞毒性。溶血实验显示Z-QCDs@M2-Migs@OHA-PP组溶血率接近0%。细胞骨架染色显示MC3T3-E1细胞充分铺展并延伸伪足。

**4.5 自由基清除能力评估**

Z-QCDs对DPPH•和ABTS•的清除效率分别约为70%和57%，对HO•的清除能力接近80%。Z-QCDs对O₂^•?的清除具有浓度依赖性，60 μg/mL时几乎完全清除。Z-QCDs的半数抑制浓度（IC50）为30 μg/mL，低于天然化合物抗坏血酸。

**4.6 体外炎症调节作用**

qRT-PCR结果显示，与Z-QCDs@M2-Migs@OHA-PP共孵育后，M1标志物IL-6、iNOS和TNF-α表达显著降低，M2标志物Arg-1、CD206和TGF-β表达升高。ELISA结果证实TNF-α和IL-6水平降低，IL-10水平升高。免疫荧光染色显示iNOS表达减少而CD206表达显著增强。

**4.7 细胞内ROS清除能力和线粒体保护评估**

Z-QCDs@M2-Migs@OHA-PP处理后，DCFH荧光信号显著减弱，抗氧化基因CAT和SOD-1表达恢复。该水凝胶能恢复JC-1 aggregates/monomers比值，降低MDA水平，恢复SOD活性和GSH/GSSG比值，减少线粒体超氧化物产生，并保护线粒体超微结构完整性。

**4.8 体外成骨分化效果**

在H₂O₂诱导的氧化应激条件下，Z-QCDs@M2-Migs@OHA-PP将ALP表达增强约2.9倍，矿化水平提高约4.4倍。成骨相关基因Runx-2、Col 1、ALP和OCN的表达在第7天和第14天均显著恢复。免疫荧光染色显示Runx-2、Col 1和OCN荧光强度分别增加约2.8倍、2.7倍和2.3倍。

**4.9 铁死亡抑制作用**

Z-QCDs@M2-Migs@OHA-PP显著减少细胞内Fe²⁺积累，下调促铁死亡蛋白ACSL4和DMT1的表达，恢复GPX4水平，抑制脂质过氧化。在铁死亡诱导剂Erastin条件下，该水凝胶有效逆转了铁死亡对ALP活性和矿化结节形成的抑制作用。体内实验证实该材料可上调骨质疏松骨缺损组织中GPX4表达。

**4.10 RNA-seq分析**

共鉴定出1653个差异表达基因（DEGs）。KEGG富集分析显示PI3K-AKT信号通路显著上调。GSEA进一步确认该通路的激活。蛋白质印迹证实AKT、PI3K和mTOR的磷酸化水平显著增加。使用PI3K-AKT通路抑制剂LY294002后，OCN表达下降，表明该通路介导成骨分化。

**4.11 体内骨再生研究**

在OVX诱导的骨质疏松小鼠模型中，Micro-CT定量分析显示Z-QCDs@M2-Migs@OHA-PP组BV/TV、Tb.Th和Tb.N显著增加，Tb.Sp显著降低。H&E和Masson染色显示该组新骨形成更多、胶原沉积更丰富。免疫荧光染色显示OCN和OSX表达显著增强，CD206表达升高而CD86和iNOS表达降低。主要器官组织学评估未发现明显毒性变化。

**五、讨论与结论**

讨论部分指出，本研究通过单细胞转录组分析证实ROS积累和铁死亡信号通路激活是驱动成骨功能障碍的关键分子机制，建立了"ROS-铁死亡"整合网络作为干预骨质疏松性骨缺损的关键靶点。设计的Z-QCD@M2-Migs@OHA-PP水凝胶系统整合了精确药物递送与智能微环境响应性，其pH/ROS双响应降解特性实现了按需释放。该水凝胶通过外源性清除与内源性防御的协同策略，有效阻断ROS介导的氧化应激级联反应，创造有利于成骨细胞存活和分化的微环境。研究还阐明了该材料通过抑制铁死亡和激活PI3K-AKT通路促进骨修复的双重机制。在OVX小鼠模型中，该水凝胶通过免疫调节和促成骨的协同作用显著改善骨再生能力。研究局限性包括：仅在啮齿动物模型中验证、含席夫碱和硼酸酯键水凝胶的合成储存方法复杂、未实现体内ROS和pH变化及水凝胶降解的实时监测、可能诱导异位骨化。

结论部分总结：本研究开发了一种可注射的pH/ROS双响应纳米复合水凝胶Z-QCDs@M2-Migs@OHA-PP，以Z-QCDs和M2-Migs为核心功能单元。在低pH和高ROS刺激下，动态席夫碱键和硼酸酯键快速断裂，导致水凝胶网络降解、Z-QCDs暴露和M2-Migs释放。Z-QCDs负责有效清除ROS、抑制炎症、促进巨噬细胞向M2表型极化并抑制铁死亡；M2-Migs负责协同增强后续的成骨分化促进。机制上，Z-QCDs@M2-Migs@OHA-PP通过激活PI3K-AKT信号通路发挥作用。在小鼠骨质疏松性骨缺损模型中，该纳米复合水凝胶通过抑制铁死亡、抑制炎症、促进M2巨噬细胞极化和增强成骨相关表型表达实现了缺损部位的再生。尽管结果仍属初步，但所报道的Z-QCDs@M2-Migs@OHA-PP纳米复合水凝胶在治疗骨质疏松性骨缺损方面显示出显著疗效，为骨损伤中的精准微环境调控提供了新策略，并展示了良好的临床转化前景。