根际木霉菌作为防治瓜果腐霉（*Pythium irregulare*）及促进草莓植株生长的多功能因子

《Biological Control》：Rhizospheric Trichoderma as multifunctional agents for controlling Pythium irregulare and enhancing strawberry plant growth

　　

木霉菌（*Trichoderma*）抑制了瓜果腐霉（*Pythium irregulare*）的菌丝生长（抑制率53–79%）。挥发性有机化合物（VOCs）和培养滤液可将病原菌生长减少高达84%。分离菌株可产生多种酶类和与植物促生（PGP）相关的代谢产物。*T. virens* 和 *T. viride* 降低了草莓根腐病的病情严重度。筛选出的菌株在田间条件下促进了草莓植株的生长。

一、研究背景与科学问题

草莓（*Fragaria* × *ananassa*）是全球重要的经济水果作物，年产量超千万吨，具有高营养价值和旺盛的市场需求。然而，草莓栽培对生物和非生物胁迫高度敏感，尤其是土传病害严重威胁植株健康、产量与果实品质。由卵菌（oomycete）如腐霉属（*Pythium* spp.）引起的根腐病是许多草莓种植区的重要病害。病原菌侵染根系后，导致根系腐烂、水分和养分吸收能力下降、根系结构完整性受损，植株表现为生长缓慢矮小、叶片黄化萎蔫、长势衰弱。该病害在高土壤湿度、排水不良的新垦种植区尤为严重，影响商业种植园和草莓苗圃。长期以来，化学防治（如甲霜灵、精甲霜灵、乙膦铝、亚磷酸钾等杀菌剂）是控制根腐病的主要手段。然而，过度使用化学杀菌剂会导致根际土壤毒性增加、生态系统污染、有益土壤微生物被消灭，并可能引发病原菌抗药性，降低防治效果。因此，探索可持续的替代防治策略成为研究热点。生物防治利用有益微生物抑制病原菌种群，是一种有前景的策略。木霉菌（*Trichoderma*）作为内生真菌，对多种作物上的腐霉属病原菌具有拮抗特性，通过重寄生、抗生作用、空间和营养竞争等机制抑制病原菌，并能诱导植物系统性防御反应。尽管木霉菌作为生防菌研究广泛，但多数研究集中于商业化菌株或非特定环境来源的分离株。相比之下，原生根际木霉菌株因对当地土壤生态环境具有更强的适应性、生态适合度和有效性而日益受到重视。基于此，研究人员提出假设：草莓根际原生木霉菌株因其对寄主植物和土壤环境的适应，可能对*P. irregulare*表现出更优的生防活性及促生特性。该研究旨在从草莓植株根系分离和鉴定木霉菌株，并在体外和温室条件下评估其生防效率，同时整合双重培养试验、温室测定、裂解酶产生评价和田间促生试验，全面覆盖生防与促生潜力，为开发基于木霉菌的可持续草莓根腐病防治策略提供科学依据。

二、研究方法概述

本研究首先从摩洛哥Gharb地区多个草莓种植区（包括Kenitra、Larache、Laouamra、Dlalha、Moulay Bouselham）的健康草莓植株根际土壤中分离木霉菌株。通过形态学（宏观和微观特征）和分子生物学方法（rDNA ITS区和EF1-α基因序列分析）对分离菌株进行鉴定，并构建系统发育树。体外拮抗活性评价采用三步策略：平板对峙培养（dual culture assay）测定直接拮抗作用；密封配对培养法（paired-plate assay）评价挥发性有机化合物（VOCs）的抑制作用；无菌培养滤液（cell-free filtrate）掺入培养基评价可扩散代谢产物的抗真菌活性。同时，对木霉菌株进行胞外水解酶（淀粉酶、纤维素酶、蛋白酶、几丁质酶、果胶酶、脂肪酶、endo-1,4-β-葡聚糖酶）定性筛选，以及植物促生特性（HCN产生、固氮能力、氨产生、铁载体产生、IAA合成、磷 solubilization、钾 solubilization）的半定量评价。温室生防试验采用麦粒-V8汁基质繁殖病原菌接种草莓幼苗，以1×10? conidia mL?1的木霉分生孢子悬浮液浇灌处理，3个月后评估根部病情严重度。田间促生试验选用草莓品种Fortuna，采用浸根法接种1×10? CFU mL?1的木霉孢子悬浮液（每两周一次共十次），4个月后测定植株生长和产量相关参数。

三、主要研究结果

1. 木霉菌株的形态与分子鉴定

从草莓根际共分离获得20株木霉菌，形态学观察显示菌落生长迅速，颜色从白色至深绿色，具有絮状或棉絮状外观及同心轮纹。显微观察显示典型木霉特征：透明有隔且高度分枝的菌丝，瓶梗对生或簇生，分生孢子光滑、球形至近球形。分子鉴定基于rDNA ITS序列的系统发育分析，将20株菌分为5个种：*Trichoderma virens*（11株）、*T. asperellum*（4株）、*T. asperelloides*（2株）、*T. hamatum*（2株）和*T. viride*（1株）。

2. 平板对峙培养中的直接拮抗作用

所有20株木霉菌在双重培养中均不同程度抑制*P. irregulare*菌丝生长，抑制率范围为53.39%至79.33%。其中菌株BBX（79.33%）、BB3（76.18%）和BB4（73.23%）抑制效果最显著。显微观察发现，与木霉菌对峙培养的病原菌菌丝出现液泡化、变形、肿胀、菌丝结构破坏和细胞内容物释放等形态学异常，表明抑制不仅源于空间竞争，还涉及对病原菌的直接生理损伤，与重寄生和水解酶的协同作用一致。

3. 挥发性有机化合物（VOCs）的间接拮抗作用

VOCs介导的拮抗是本研究检测到的最强抑制机制之一。所有木霉菌株产生的VOCs均能显著抑制病原菌生长，抑制率介于26.17%至84.18%之间。其中BB4和TRI4菌株的VOCs抑制效果最强（84.18%），BB2、BB3、BB4、BBX、TRI3和TRI4六个菌株的VOCs抑制率超过70%。VOCs无需物理接触即可发挥强抑制作用，表明挥发性代谢产物在拮抗中发挥重要作用。

4. 培养滤液中可扩散代谢产物的抗真菌活性

木霉菌株的无细胞培养滤液对*P. irregulare*表现出菌株依赖性显著的抑制效果。抑制率最低为TRI5的5.44%，最高为TRI2的78.94%，共有5株菌的滤液抑制率超过50%。TRI2滤液的强活性表明该菌株无需直接物理接触即可发挥显著抗真菌作用，而部分在双重培养中拮抗活跃但滤液活性较弱的菌株，其抑制作用可能更依赖于竞争、抗生作用或挥发性代谢产物等其他机制。主坐标分析（PCA）依据VOCs和滤液抑制率将菌株聚类区分，基于此选择Tri3、BBX、Tri4、Tri2、BB4和TriY六株具有代表性和对比性抑制特征的菌株进入后续试验。

5. 胞外水解酶与植物促生特性的定性评价

半定量筛选显示不同木霉菌株间酶活和促生特性存在显著差异。菌株BB1、BB2和BB4表现出广谱水解酶活性（淀粉酶、纤维素酶、endo-1,4-β-葡聚糖酶强阳性）和极强磷酸盐 solubilization能力（+++++）。BB2和Tri10同时兼具固氮和铁载体产生能力，展现出营养 mobilization 和病原防控的双重潜力。多数菌株具有蛋白酶活性，几丁质酶活性在部分菌株中检出。促生特性方面，BB2和Tri10具有显著钾 solubilization（+++至++++）和有效固氮能力（+++至++++），Tri10同时显示显著铁载体合成（++至+++）。IAA合成总体较低但BB2达到中等水平（++）。HCN产生在菌株间差异大，BB1强阳性（++++），部分菌株缺失。

6. 温室生防试验

在温室条件下，六株筛选菌株对草莓根腐病的防治效果存在显著差异。接种*P. irregulare*三个月后，*T. virens* Tri3、Tri2和*T. viride* TriY处理组病情严重度显著降低，分别为16.6%、25%和37.5%，表现出最强的病害抑制效果。值得注意的是，体外培养中拮抗活性最高的BBX和BB4在温室条件下的保护效果较弱，表明强体外拮抗活性并不能完全预测植物-土壤系统中的生防表现，根际定殖能力、环境适应性和与土著微生物的竞争等因素同样关键。

7. 田间植物促生效果评价

田间试验中，*T. viride* TriY和*T. virens* Tri3处理显著提高了草莓植株的生长和产量相关性状。TriY和Tri3持续表现出最高的干物质和鲜重、更大的株高和更高的叶绿素含量（SPAD值），并促进了叶面积增加和果实性状改善。TriY特别显著增加了果实数量和尺寸，Tri3则显著促进叶片发育。相比之下，BBX和Tri4等菌株在各测定参数上表现较弱或不稳定，接近或低于未处理对照。结果表明木霉菌株间存在显著的菌株依赖性促生差异，仅有部分菌株兼具强促生和增产效果，是田间应用的理想候选菌株。

四、讨论与结论总结

本研究表明，草莓根际原生木霉菌株是兼具生防和促生功能的多功能农业微生物资源。研究讨论部分着重分析了体外拮抗活性与温室防效之间的差异：尽管BBX和BB4在双重培养中抑制率最高，但温室防效较弱；而Tri3、Tri2和TriY在温室中表现最佳，说明根际竞争力、环境适应性和持久定殖能力对实际生防效果至关重要。强体外拮抗性并非充分预测指标，需在更真实的生态条件下综合评价。VOCs和可扩散代谢产物在拮抗中发挥重要作用，六株菌的VOCs抑制率超过70%，TRI2滤液抑制率高达78.94%，支持挥发性物质和抗菌代谢产物是重要抑病机制。酶学筛选表明纤维素酶和β-葡聚糖降解酶对卵菌细胞壁降解尤为重要，几丁质酶活性应视为广谱水解潜力的一部分而非直接作用于*P. irregulare*的机制。温室和田间结果的耦合表明Tri3（*T. virens*）和TriY（*T. viride*）兼具优异的病害抑制和促生增产功能，是极具开发前景的多功能菌株。研究结论明确指出：20株木霉菌的筛选揭示了菌株依赖性显著的拮抗机制差异；*T. virens* Tri3和Tri2以及*T. viride* TriY在温室条件下对*P. irregulare*引起的根腐病抑制效果最佳，Tri3和TriY在田间条件下表现出突出的促生增产潜力；体外与体内表现的差异强调仅凭实验室拮抗不足以筛选实际应用菌株，应在渐进真实的条件下评估生态表现。研究同时指出，将这些有前景的菌株转化为商业化生防产品仍需系统工作，包括定量酶活测定、代谢物鉴定、根系定殖与持久性研究、寄主响应分析、制剂优化以及多地点多品种的田间验证试验。目前Tri3、Tri2和TriY应视为候选菌株而非即用型产品，其开发为本地适应性木霉菌生物防治方案奠定了重要基础，对推动可持续草莓生产具有重要意义。