一种响应过氧化氢的近红外荧光探针，用于可视化急性结肠炎和胃肠道肿瘤模型中的氧化还原相关信号，并监测与治疗相关的变化

《Bioorganic Chemistry》：A hydrogen peroxide-responsive near-infrared fluorescent probe for visualizing redox-associated signals in acute colitis and gastrointestinal tumor models and monitoring treatment-related changes

　　

摘要

炎症性肠病和胃肠道肿瘤常伴有氧化还原失衡，但用于可视化过氧化氢相关氧化还原变化及监测干预反应的非侵入性工具仍然有限。本研究旨在开发并临床前评估HD-YSY，这是一种由过氧化氢激活的硼酸掩蔽半花青素化合物。高效液相色谱法支持了脱保护荧光团HD的形成。在指定的溶液条件下，该探针在670纳米激发下于760纳米处产生近红外发射，在100秒的观察时间内荧光强度迅速增加，其检测限为0.15微摩尔，并且在pH 6.0至9.0范围内仍保持明显的响应。在鼠前胃癌细胞中，活化后的荧光产物优先定位于线粒体（与Mito-Tracker Green的Pearson相关系数为0.90，而与Lyso-Tracker Green为0.65）。在匹配的采集条件下，荧光强度随着急性结肠炎模型中右旋糖酐硫酸钠浓度的增加而增强，在3T3成纤维细胞和SW480结直肠癌异种移植物中表现不同，并在药物干预过程中发生变化。这些信号被解释为与过氧化氢相关的氧化还原状态的半定量读数，而非细胞内或体内的过氧化氢绝对浓度。主要的进展是将溶液实验、细胞实验、急性结肠炎实验、异种移植物实验和治疗监测实验整合在一个平台上；该探针本身不具备治疗作用，还需要进一步的机制学、药代动力学和疾病模型验证。

引言

炎症性肠病，包括溃疡性结肠炎和克罗恩病，是一种慢性复发性胃肠道炎症性疾病[1]、[2]、[3]、[4]、[5]、[6]、[7]。过氧化氢（H₂O₂）是一种相对寿命较长的活性氧物种，参与氧化还原信号传导，但其产生和清除失衡时也可能导致氧化损伤。在肠上皮细胞和免疫细胞中，常规的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶主要生成超氧阴离子（O₂•^?），后者可通过酶促或自发途径转变成过氧化氢；而双氧化酶可以直接释放H₂O₂。在黏膜表面，双氧化酶2产生的活性氧物种有助于抗菌防御和上皮-微生物群相互作用；然而，肠道屏障功能及细菌转移的限制依赖于多种协调机制，包括黏液、上皮完整性、紧密连接、免疫球蛋白A、常驻微生物群和抗菌效应分子。过氧化氢可调节氧化还原敏感通路，如核因子Erythroid 2相关因子2和核因子κB，这些因子是抗氧化和炎症反应的调节因子。在肠道炎症期间，吞噬细胞中的NOX2在呼吸爆发过程中生成超氧阴离子，随后发生转变产生过氧化氢。活性氧产量的增加以及抗氧化防御能力的改变可能导致组织氧化还原平衡失调，甚至可能超出内源性抗氧化系统的处理能力。在Fe²⁺等氧化还原活性过渡金属的作用下，过氧化氢可参与芬顿反应生成羟基自由基（•OH）。这些活性氧物种可促进蛋白质羰基化、脂质过氧化和DNA氧化损伤，在持续氧化应激下可能导致基因组不稳定和上皮屏障功能障碍[8]、[9]、[10]、[11]。持续的活性氧介导的氧化应激还可能与肿瘤发生相关；但这并不意味着过氧化氢单独驱动了所有恶性转化阶段。因此，本文将过氧化氢相关的氧化还原活性视为实验性的成像目标，以及局部氧化或炎症活动的潜在指标，而非独立的诊断生物标志物。

近红外荧光成像相比可见光成像具有更低的自荧光和更强的组织穿透能力[12]、[13]、[14]。与始终处于激活状态的荧光团不同，可激活探针会经历分析物依赖性的化学转化，从而提高信噪比[15]、[16]、[17]。对过氧化氢响应探针的有意义比较应不仅涉及激发和发射波长、荧光强度变化、报告的响应或观察时间以及检测限，还应包括识别化学性质、亚细胞分布、基质稳定性、疾病模型相关性以及信号随时间的变化。相关数值比较见表S1[18]、[19]、[20]、[21]、[22]、[23]、[24]、[25]、[26]、[27]、[28]、[29]、[30]、[31]、[32]、[33]、[34]、[35]、[36]、[37]。由于不同研究中的实验条件和操作定义各异，这些数值仅具描述性，并非直接对比结果。

本研究旨在开发并临床前评估HD-YSY，作为一种在匹配实验条件下可视化过氧化氢相关氧化还原变化的活性荧光探针（示意图1）。研究目标包括：（i）合成并结构表征HD-YSY；（ii）分析其反应产物、光谱响应、校准范围、动力学特性、pH值和温度依赖性以及溶液相选择性；（iii）评估其细胞相容性、细胞内荧光定位以及对体外过氧化氢和药理学氧化还原调节的响应；（iv）在急性右旋糖酐硫酸钠结肠炎和皮下胃肠肿瘤模型中评估其荧光变化，包括选定的干预实验。所用硼酸触发机制和氧化脱硼反应并非新颖发现。主要进展在于将670纳米激发和760纳米近红外发射与溶液实验、细胞实验、急性结肠炎实验、异种移植物实验及治疗监测实验整合到一个临床前平台上。细胞和动物实验结果为半定量比较，不代表过氧化氢的绝对浓度或治疗效果。

章节摘录

材料与方法

印度酚（货号1018212，Leyan，上海，中国）。DAPI溶液（5微克/毫升）（C0066，北京Solarbio科技有限公司）。示意图使用www.figdraw.com中的组件制作。

探针设计、合成及反应验证

HD-YSY通过用苯硼酸苯甲醇酯触发剂掩蔽半花青素荧光团HD的酚基团来构建（示意图2）。通过H₂O₂介导的氧化脱硼反应释放HD（示意图3）。图S7-S10展示了HD-YSY的消耗（约19.4分钟）以及HD的出现（约8.8分钟）（图S1）。

讨论

本研究是一项概念验证性成像研究。所采用的苯硼酸触发机制并非全新的反应方式，也不在所有分析指标上都具有绝对优势。HD-YSY结合了H₂O₂引发的激活作用、670纳米激发和760纳米近红外发射，并在溶液实验、细胞实验、急性结肠炎实验、异种移植物实验及治疗监测实验中进行了评估。表1列出了各比较探针的时间范围。

结论

HD-YSY在670纳米激发下经H₂O₂触发后产生荧光，其荧光强度随H₂O₂浓度线性增加（Y = 14,580.61×x + 7147.96；R² = 0.9926），检测限为0.15微摩尔。在100秒的动力学观察时间内荧光强度迅速上升，并且在pH 6.0至9.0范围内保持明显响应。高效液相色谱法支持了HD的形成。在细胞实验中，

CRediT作者贡献声明

于思艳：撰写——审稿与编辑、初稿撰写、监督、资源提供、实验设计、概念构思。于涵鼾：撰写——审稿与编辑、可视化处理、资源提供、实验设计、数据管理、概念构思。朱鹏伟：初稿撰写、验证、软件开发、方法学设计、实验设计、数据管理。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

本研究得到了江苏省重点专科建设专项资助（2024SZDFC）的支持。作者感谢Scientific Compass公司的Ma Xin女士（www.shiyanjia.com）在共聚焦分析方面提供的宝贵帮助。

于思艳|于涵鼾|朱鹏伟

中国无锡214023，江南大学附属儿童医院医学实验室