基于结构的优化、体外表征以及三萜类化合物衍生物作为强效脯氨酰内肽酶抑制剂的ADMET预测

《Bioorganic Chemistry》：Structure-based optimization, in vitro profiling, and ADMET prediction of Celastrol derivatives as potent prolyl endopeptidase inhibitors

　　

摘要

脯氨酰内切酶（PREP）是神经系统疾病的潜在治疗靶点。本研究通过对三萜类化合物库进行筛选，鉴定出雷公藤红素作为一种新型PREP抑制剂（IC?? = 33.35 μM）。此外，基于该先导化合物设计并合成的三个衍生物中，Ce-2（C3位乙酰化）和Ce-3（C3位丁酰化）显示出显著增强的活性，IC??值分别为4.46 μM和3.89 μM，与雷公藤红素相比分别提高了7.5倍和8.6倍。动力学研究表明，两者均表现为混合型抑制剂（K?值分别为4.40 μM和4.17 μM）。分子对接提示了它们的推测结合模式：Ce-2与Asn477、Ser554和His680形成极性接触，并在S2亚位点与Arg643接触，而Ce-3形成了涉及Arg643、Asn477和Asp149的额外极性相互作用。随后的分子动力学模拟表明，两种化合物均保持在PREP结合腔内，但表现出不同的相互作用特征：Ce-3与几个典型的口袋残基保持频繁接触，而Ce-2在所采用的分析标准下缺乏持续的直接接触，表明其详细结合机制需要进一步阐明。AutoDock Vina对Ce-2和Ce-3分别给出?7.8和?7.9 kcal/mol的对接评分，支持了它们在PREP腔内的推测结合模式。ADMET分析既发现了有利的参数，也揭示了重要的可开发性局限。细胞实验证实，两种化合物均能以浓度依赖性方式有效抑制神经元细胞中的内源性PREP活性，且在测试条件下无显著细胞毒性。本研究将Ce-2和Ce-3鉴定为早期先导样化合物，为基于雷公藤红素的PREP抑制剂进一步优化奠定了基础。

引言

脯氨酰内切酶（PREP，EC 3.4.21.26）是一种丝氨酸蛋白酶，能特异性切割脯氨酸残基羧基端的肽键[1]、[2]。通过调节多种生物活性肽（包括神经递质和神经激素），PREP参与学习、记忆、情绪和疼痛感知等多样化的生理过程[3]、[4]。PREP表达和活性的失调与多种神经退行性疾病有关，包括阿尔茨海默病和帕金森病。除了其在神经肽代谢中的作用外，PREP还被报道可影响细胞内蛋白质稳态和自噬，从而促使其病理性蛋白（如β-淀粉样蛋白、Tau蛋白和α-突触核蛋白）的积累[5]、[6]、[7]。越来越多的遗传学、药理学和机制学证据支持了PREP作为治疗靶点的合理性。PREP基因敲除小鼠在帕金森病模型中对α-突触核蛋白病理改变和认知功能下降表现出抵抗力，提示PREP功能的降低可能具有保护作用[8]、[9]。重要的是，越来越多的证据表明，PREP通过催化性和非催化性机制共同促进神经退行性病变的发生。PREP可以直接与α-突触核蛋白相互作用并促进其聚集，这一过程独立于其酶活性，凸显了PREP介导的蛋白质-蛋白质相互作用的重要性[10]。PREP在阿尔茨海默病和帕金森病患者受累脑区的表达升高，并与疾病严重程度相关[11]。此外，选择性PREP抑制剂KYP-2047在多种神经退行性疾病的实验模型中已显示出有益效果，尽管其机制可能超越简单的催化抑制[12]。

然而，针对PREP的治疗策略也面临着需要慎重考虑的诸多挑战。根据公共基因组数据库，PREP的失功能不耐受评分较高，表明该蛋白在人类中高度受限。这意味着PREP具有重要的生理必需功能，完全抑制可能会带来风险。因此，开发靶向PREP的治疗药物需要采取平衡策略，在实现足够的治疗性抑制的同时保留必要的生理功能。关键的是，PREP在神经退行性疾病中的致病作用超出了其经典的肽酶活性范畴。最新的研究发现，PREP通过直接的蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs）发挥非蛋白酶解功能[10]。正是由于PREP在肽水解和蛋白质稳态中的双重核心作用，PREP已成为一个极具前景的干预神经退行性疾病进展的分子靶点[13]、[14]。

三萜类天然产物长期以来被认为是一个有价值的先导化合物来源，因其在药物发现中具有结构复杂性和多样的药理活性[15]、[16]、[17]。为了系统探索该化学类别中潜在的PREP抑制剂，我们建立了包含16种结构多样的天然三萜化合物的筛选库。然而，传统天然产物筛选往往在早期开发阶段因药物性质欠佳而面临较高的淘汰率。因此，我们实施了合理的筛选策略，将两种临床成功的三萜衍生物类药物——奥马洛酮（RTA 408）和羧甲基胆烷醇二钠[18]、[19]、[20]、[21]纳入筛选。这些化合物是天然三萜的结构优化版本，在保留母体骨架核心生物活性的同时，通过临床验证证明了其良好的成药性、有利的安全性特征和明确的药效机制[18]、[19]、[20]、[21]。通过将上述基准分子与自然三萜化合物共同纳入筛选，我们的筛选方法旨在利用这些先进的起始点，在已成功优化的三萜框架中鉴定潜在的PREP抑制活性，从而可能绕过早期药物化学中常见的挑战，加速有前景的候选结构的发现。

基于我们先前建立的利用小鼠脑S9提取物的筛选系统[22]，本研究成功应用该平台筛选天然三萜中的PREP抑制剂。雷公藤红素（TP-16）被鉴定为一种新型PREP抑制剂，其IC₅₀值为33.35 μM（图1）。鉴于该化合物结构可修饰性良好，我们对雷公藤红素的C-3位和C-30位羟基进行了定向结构修饰，以探索构效关系。三种雷公藤红素衍生物经系统合成后通过酶学和细胞学实验进行了评估。进一步的机制学见解通过抑制动力学和分子对接研究获得。在神经元模型中，优化后的衍生物能有效抑制内源性PREP活性，同时表现出低细胞毒性，突显了其作为中枢神经系统靶向PREP抑制剂的潜力。本研究为基于天然三萜开发PREP抑制剂提供了新的结构模板和实验证据。

章节摘要

化学试剂与材料

18种化合物和PREP特异性抑制剂KYP-2047由上海中医药大学交叉科学研究院系统药代动力学中心提供。化合物以二甲基亚砜（DMSO，Sigma，美国）溶解并经超声处理制成20 mM储存液。Z-GP-ACM由本实验室合成[23]。PBS（0.1 M，pH 7.4）以Milli-Q水（Millipore，Bedford，美国）配制。化合物以LC级DMSO（Tedia，美国）溶解。

三萜类PREP抑制剂的筛选

天然产物以其多样的化学结构和广泛的生物活性，始终是药物发现的重要来源，尤其是新型治疗药物的开发[25]、[26]。基于我们建立的PREP抑制剂筛选平台，我们筛选了一个包含18种三萜类化合物的库，其中包括16种天然来源化合物和2种市售三萜化合物（图2和图3A）。随后，我们评估了它们的抑制潜力。

结论

综上所述，通过对三萜类化合物库的筛选，我们鉴定出雷公藤红素作为具有中等活性的新型PREP抑制剂骨架（IC?? = 33.35 μM）。基于这一发现，我们合理地设计并合成了三个衍生物（Ce-1至Ce-3），并揭示了关键的构效关系：C30位的酯化显著降低了活性，而C3位的酰化则显著增强了效价。具体而言，Ce-2和Ce-3表现出

CRediT作者贡献声明

王天歌：撰写——初稿，方法论，调查，数据整理。张晶：撰写——初稿，方法论，调查，数据整理。戴畅：调查，数据整理。黄蔚然：软件，数据整理。朱晓雷：软件，数据整理。边坤杰：方法论，形式化分析。焦贤婷：指导，经费获取，概念化。钱兴凯：调查，经费获取，数据整理。邹立伟：撰写——审阅与

利益冲突声明

作者声明，不存在任何可能影响本文所报告工作的已知经济利益冲突或个人关系。

致谢

本工作获得上海市自然科学基金一般项目（23ZR1461100）、国家自然科学基金（批准号：82304611）、医院资助临床研究（24XHCR01A）以及上海市卫生健康委员会（202440045）的经费支持。

王天歌|张晶|戴畅|黄蔚然|朱晓雷|边坤杰|焦贤婷|钱兴凯|邹立伟

上海交通大学医学院附属新华医院儿科感染科，上海，中国