巴厘公牛精液中PRM1、TNP1与MARCH1转录本丰度的初步评估

《Cogent Food & Agriculture》：Preliminary evaluation of PRM1, TNP1, and MARCH1 transcript abundance in semen of Bali bulls

　　

摘要
具有高总活动精子数（Total Motile Spermatozoa, TMS）的优良公牛每年可生产显著更多的冷冻精液剂量，将精液生产评估与基因表达分析相结合，可能为评估种公牛提供补充信息。本研究旨在分析巴厘公牛的精液生产力以及鱼精蛋白1（protamine 1, PRM1）、过渡核蛋白1（Transition Nuclear Protein 1, TNP1）和膜相关环指蛋白1（membrane-associated ring-CH 1, MARCH1）基因在巴厘公牛中的表达。研究收集了Singosari国家人工授精中心（SNAIC）28头巴厘公牛的次级数据，包括精液体积、活力和精子浓度，并据此计算每次射精的TMS。根据TMS的显著差异（P<0.05），将公牛分为高生产力组（n=9）和低生产力组（n=3）。从冷冻-解冻精子中提取RNA，采用实时荧光定量PCR（Real-Time PCR）以2^?ΔΔCT法量化基因表达。高生产力组平均TMS（299,992±115,974 ×10⁶ 精子/年）和冷冻精液细管产量（12,000±4,639 细管/年）显著高于低生产力组（P<0.05），而PRM1、TNP1和MARCH1的表达在两组间无显著差异。这些结果表明，PRM1、TNP1和MARCH1的表达与生产力差异无关，这可能是由于样本量小且不平衡导致统计效能有限。TNP1和MARCH1仍是有待更大规模研究验证的候选基因。
关键词：冷冻精液；标记基因；相对表达；总活动精子数；转录组

**巴厘公牛精液生产力相关候选基因表达研究解读**

**研究背景与意义**

全球肉类需求的持续增长对家畜繁殖效率提出了更高要求，而公畜精液品质直接关系到遗传改良的进程与生产效率。长期以来，家畜选育依赖于精液体积、精子浓度、活力、畸形率、顶体完整性及质膜完整性等表型指标。然而，表型选育存在周期长、受环境因素干扰大等局限，分子标记辅助选择则有望通过早期、精准的遗传评估加快遗传进展。在这一背景下，精子发生相关基因的表达分析逐渐成为评估种公畜繁殖潜力的重要补充手段。

印尼本土品种巴厘牛（Bos sondaicus）以其适应性强、耐粗饲等优良特性，在印尼国家育种计划中占据重要地位。然而，与荷斯坦-弗里生牛或西门塔尔牛等商业化主流品种相比，巴厘牛在分子水平上的研究相对匮乏，其精液生产力的遗传基础至今尚未被充分阐明。因此，开展巴厘公牛精液生产力相关分子标记的探索性研究，对于优化本地品种的选育策略和维护遗传多样性具有重要的科学价值与实践意义。

**研究目的与核心问题**

本研究旨在分析巴厘公牛的精液生产力，并探究鱼精蛋白1（PRM1）、过渡核蛋白1（TNP1）及膜相关环指蛋白1（MARCH1）三个候选基因的表达水平与精液生产力的关联。PRM1编码富含精氨酸的核蛋白，在精子细胞单倍体阶段替代组蛋白，参与染色质浓缩和DNA保护；TNP1在组蛋白向鱼精蛋白转换过程中发挥关键作用，其正常表达对精子细胞核压缩至关重要；MARCH1作为E3泛素连接酶，参与精子成熟过程中的蛋白质泛素化修饰，已有研究报道其表达变异与奶牛精液品质性状相关。该研究的开展将为后续大规模转录组研究提供基础数据，有助于深化对本地品种精子发生分子机制的理解。

**主要技术方法**

研究以Singosari国家人工授精中心（SNAIC）为样本来源，收集了28头年龄4至11岁巴厘公牛的次级精液数据，包括精液体积、个体活力和精子浓度。依据年龄分层TMS分析，选取TMS均值最高的10岁龄公牛（n=9）作为高生产力组，TMS均值最低的6岁龄公牛（n=3）作为低生产力组，以确保生物学对比的极端性。精子RNA提取采用Direct-zol RNA Miniprep Kit，逆转录使用ReverTra Ace^? qPCR RT Master Mix，RT-qPCR采用SsoFast EvaGreen Supermix，以PPIA为内参基因，通过2^?ΔΔCT法计算相对表达量。统计分析采用单因素方差分析和Mann-Whitney U检验，显著性水平设为p<0.05。

**研究结果**

**1. 巴厘公牛精液生产力**
年龄显著影响TMS值（p<0.05）。10岁龄组的平均TMS（6,397±3,108 ×10⁶ 精子/次射精）最高，6岁龄组（3,269±1,830 ×10⁶ 精子/次射精）最低。高生产力组的年度成功采集次数（46.78±0.44 次/年）、年度TMS（299,992±115,974 ×10⁶ 精子/年）和冷冻精液细管产量（12,000±4,639 细管/年）均显著高于低生产力组（p<0.05），且高生产力组的细管年产量超过了印尼农业部设定的本地品种公牛7,500细管/年的最低国家标准。这一发现与既往报道的巴厘公牛在优化管理下年产约11,843细管的水平相符，同时高于马都拉牛（6,627-7,980细管/年）和Pasundan牛的年均TMS（4,782±1,283 ×10⁶），进一步印证了巴厘公牛优良的精液生产能力。研究同时指出，年龄与生产力分组之间存在完全混杂——高生产力组全部为10岁龄，低生产力组全部为6岁龄，因此无法在统计学上分离年龄效应与生产力效应对基因表达的影响。

**2. PRM1、TNP1和MARCH1基因表达**
PRM1基因表达在高、低生产力组间无显著差异（Mann-Whitney U=3.0, p=0.064）。低生产力组的PRM1平均相对表达量（1.05±0.40）略高于高生产力组（0.68±1.33），但高生产力组内变异系数高达约196%，表明该组个体间PRM1表达存在极大异质性，均值难以代表组内整体水平。TNP1基因表达在两组间亦无显著差异（Mann-Whitney U=15.0, p=0.864），但高生产力组的表达量（1.89±1.35）在数值上高于低生产力组（1.00±0.07），呈现值得进一步探究的趋势。MARCH1基因表达在两组间同样未达显著水平（Mann-Whitney U=17.0, p=0.600），不过高生产力组的平均表达量（1.83±1.56）高于低生产力组（1.05±0.40）。

研究人员指出，上述非显著结果不应被解读为这三个基因与精液生产力无关。鉴于样本量小（高生产力组n=9，低生产力组n=3）且组间样本量不平衡，统计效能有限，真实存在的生物学差异可能未能被有效检测。

**讨论与结论**

在讨论部分，研究人员对三个候选基因的发现进行了深入分析。PRM1表达在不同品种和不同生产力指标下的研究结果存在差异——在婆罗门牛和弗里生-荷斯坦牛中未观察到显著差异，但在Pasundan牛、利木赞牛及Frieswal杂交公牛中，高活力或高繁殖力组的PRM1表达更高。这种跨品种的不一致性提示PRM1表达具有背景依赖性，可能受到品种特异性精子发生调控、饲养管理条件和评估表型的共同影响。TNP1在精子发生中负责组蛋白向鱼精蛋白的逐步替换，高生产力组TNP1表达的数值升高与其在支持精子发生效率中的机制重要性相呼应，尽管未达统计显著，但与既往在Vrindavani公牛中的非显著结果具有一致性。MARCH1作为E3泛素连接酶家族成员，参与精子细胞顶体形成、鞭毛发育及精子细胞头部压缩等过程。中国荷斯坦公牛的GWAS研究将MARCH1与精液体积、精子浓度和活动精子数显著关联，本研究观察到的MARCH1表达趋势为该基因的候选价值提供了初步支持。

蛋白质互作网络分析（STRING）显示，PRM1与TNP1在精子发生网络中直接互作，而MARCH1则通过泛素-蛋白酶体途径与NPLOC4和UBE2G2形成较远端的互作关系，提示精子发生是一个涉及众多基因的复杂调控网络，单一基因难以作为独立的标记，未来的标记物开发应采用通路层面的整体分析策略。

研究结论指出，作为一项初步探索性研究，PRM1、TNP1及MARCH1的表达结果需谨慎解读，不应外推到特定研究群体和条件之外。主要限制包括：样本量小且组间不平衡，导致统计效能降低；年龄与生产力分组完全混杂，无法区分两者的独立效应；SNAIC公牛均经过国家标准的严格筛选，群体遗传异质性较低。未来研究应扩大样本量、纳入年龄匹配且TMS水平不同的公牛，并采用RNA-Seq等全转录组分析手段，同时补充精子DNA完整性、质膜完整性、顶体完整性和形态畸形率等精液品质指标，以期更全面地解析巴厘公牛精液生产力的分子调控机制，为本地品种的遗传选育提供科学依据。