米替福新调节白色念珠菌和热带念珠菌的形态发生与锌代谢相关基因表达

《Microbiology Spectrum》：Miltefosine regulates gene expression related to morphogenesis and zinc metabolism in Candida albicans and Candida tropicalis

　　

摘要
白色念珠菌（Candida albicans）和热带念珠菌（Candida tropicalis）是引起念珠菌病的主要形成菌丝病原体。抗真菌耐药性的上升凸显了对新治疗策略的需求。米替福新（Miltefosine, MFS）是一种烷基磷酸胆碱，被指定为治疗侵袭性念珠菌病的孤儿药，对念珠菌属（Candida spp.）已显示出抑制、杀真菌和抗生物膜效应。在本研究中，研究人员采用微生物学和转录组学方法，探讨MFS抑制白色念珠菌和热带念珠菌生长及菌丝形成的潜在机制。所有分离株的MFS最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration, MIC）范围为1至4 μg/mL，在2–8 μg/mL浓度下观察到抗生物膜形成效应，在16–128 μg/mL浓度下观察到对成熟生物膜的效应。MFS损害酵母菌在聚苯乙烯表面的黏附，抑制在不同菌丝诱导培养基中的酵母菌向菌丝转变，并引起细胞壁中几丁质和壳聚糖暴露的改变。MFS对菌丝形成的抑制效应可部分归因于对毒力及转录因子相关基因表达的负调控，如白色念珠菌中的ECE1、HWP1、ALS3、EFG1、RAS1、CYR1、TEC1、NGT1和CEK1，以及热带念珠菌中的ALS1、SAP3、EFG1、BCR1和NGT1。此外，RNA测序（RNA-seq）和定量聚合酶链反应（qPCR）分析突显了响应MFS而上调最显著的基因富集于锌代谢通路，尤其是锌载体蛋白（zincophore）PRA1和锌转运蛋白ZRT1与ZRT2；在补锌培养基中，MFS处理下观察到真菌生长增强。本研究数据为进一步阐明MFS抑制生长和菌丝形成的作用模式提供了证据，特别是锌代谢参与MFS诱导的应激反应。

论文解读：米替福新对白色念珠菌与热带念珠菌形态发生及锌代谢的调控机制

**研究背景与问题**
念珠菌属（Candida）是黏膜和系统性感染中最常见的病原体，侵袭性念珠菌病和念珠菌血症每年约影响150万人，死亡率高达约65%。约50%的病例由白色念珠菌（Candida albicans）引起，而热带念珠菌（Candida tropicalis）在拉丁美洲、非洲和亚洲国家是第二常见的菌种。这两种菌均被世界卫生组织列为高优先级真菌病原体，其致病性主要依赖于酵母菌向假菌丝/菌丝形态的转变以及生物膜形成能力。生物膜因其细胞外基质、外排泵过表达和持久性细胞的存在，对宿主免疫系统和抗真菌药物表现出高度耐受性。目前临床可用的抗真菌药物仅限三类（唑类、棘白菌素类和多烯类），且仅有棘白菌素是治疗念珠菌血症伴生物膜的参考药物，治疗选择极为有限。米替福新（Miltefosine, MFS）作为一种烷基磷酸胆碱，原用于乳腺癌和利什曼病治疗，已被美国食品药品监督管理局指定为侵袭性念珠菌病的孤儿药，其对多种病原真菌具有广谱抗菌活性。尽管已有研究表明MFS能抑制念珠菌生长和生物膜形成，但其抑制菌丝形成和生物膜毒力的分子机制尚不完全清楚，特别是在热带念珠菌中的转录组水平研究仍属空白。因此，本研究旨在通过表型与转录组学整合方法，揭示MFS在白色念珠菌和热带念珠菌中抑制生长、菌丝形成和生物膜形成的分子机制。

**研究内容及技术方法**
本研究的菌株来源包括实验室保藏和临床分离株：5株白色念珠菌（SC5314及4株临床血流感染分离株）和6株热带念珠菌（ATCC 200956及5株临床分离株，其中3株来自血流感染、2株来自口咽感染），均来自圣保罗大学化学治疗实验室和隆德里纳大学Furlaneto实验室的保藏库。主要技术方法包括：微量肉汤稀释法测定最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MFC）；结晶紫染色和XTT还原法评估生物膜形成和成熟生物膜；荧光显微镜观察形态发生；流式细胞术定量细胞壁成分暴露（几丁质、壳聚糖、β-1,3-葡聚糖和甘露聚糖）；实时定量PCR（qPCR）检测毒力基因表达；RNA-seq转录组测序分析热带念珠菌全基因表达谱，并进行KEGG和基因本体富集分析；补锌培养基生长曲线实验验证锌代谢在MFS应激中的作用。

**研究结果**

**MFS对浮游细胞和生物膜各阶段的影响**
MFS对所有白色念珠菌和热带念珠菌分离株的MIC范围为1–4 μg/mL，包括氟康唑耐药株，MFC为2–8 μg/mL，显示杀菌作用。在黏附阶段，MFS显著降低了酵母菌在聚苯乙烯表面的黏附能力（白色念珠菌减少19%–37%，热带念珠菌减少17%–75%）。在生物膜形成阶段，2–8 μg/mL MFS即可抑制生物膜形成，而成熟生物膜则需要16–128 μg/mL。FUN-1荧光染色证实了浓度依赖性的细胞死亡增加，且MFS对白色念珠菌生物膜代谢活性的抑制强于热带念珠菌。

**MFS对酵母菌-菌丝转变的抑制**
在多种菌丝诱导培养基（RPMI-MOPS、Lee、SM-GlcNAc、液态和固态Spider培养基）中，MFS在亚抑菌浓度下即可完全或部分抑制菌丝/假菌丝的形成。固态Spider培养基上，MFS导致菌落边缘菌丝结构减少，提示接触诱导的菌丝形成途径可能对MFS部分耐受。qPCR结果显示，MFS显著下调了白色念珠菌中黏附素基因（HWP1、ALS3）、念珠菌素基因（ECE1）、N-乙酰葡糖胺转运蛋白基因（NGT1）和菌丝调控因子基因（EFG1、TEC1、CYR1、RAS1、CEK1）；热带念珠菌中则下调了BCR1、EFG1、NGT1、SAP3、ALS1和CDR1。RNA-seq进一步发现，MFS上调了菌丝抑制因子NRG1（CTRG_04979）、WOR2（CTRG_02521）和CRZ2（CTRG_03134）的基因表达，从转录水平解释了MFS的菌丝抑制效应。

**MFS对细胞壁结构成分暴露的影响**
流式细胞术定量显示，MFS处理导致白色念珠菌细胞壁中壳聚糖暴露减少、几丁质暴露增加，而热带念珠菌中几丁质和壳聚糖暴露均显著增加。β-1,3-葡聚糖和甘露聚糖在两种菌中均无显著变化。这些差异提示MFS影响了两种菌的细胞壁重塑机制。

**热带念珠菌全转录组分析**
RNA-seq鉴定出975个差异表达基因（DEGs），其中424个基因在MFS处理下上调，551个基因下调。主成分分析显示MFS处理是转录变异的主要来源（PC1解释88.9%的方差）。KEGG富集分析显示，核糖体生物合成、核糖体、RNA聚合酶、嘌呤代谢、碳代谢、氨基酸代谢等通路显著富集，其中翻译和转录相关通路主要表现为下调，而部分代谢通路（如脂肪酸降解、甘氨酸/丝氨酸/苏氨酸代谢、一碳叶酸池）则出现特定步骤的上调，提示MFS处理引发了代谢重编程。STRING基因本体分析显示，膜转运蛋白活性和RNA结合是主要富集的分子功能。在锌代谢方面，以log2FC > 7和P ≤ 0.001的严格标准筛选出PRA1（CTRG_03753）、ZRT2（CTRG_01372）、ZRT1/ZRT101（CTRG_03752）等锌相关基因显著上调。

**锌补充对MFS耐受性的影响**
在锌特异性限锌培养基中，添加ZnSO?·7H?O（9 μM）显著促进了热带念珠菌的生长。在YPD富培养基中，MFS亚抑菌浓度（0.5–2 μg/mL）处理下，补锌组的真菌生长明显优于未补锌组。剂量反应实验进一步证实，在2.5和3.5 μg/mL MFS下，补锌能使两种热带念珠菌分离株恢复生长，而缺锌条件下无生长。qPCR验证了PRA1、ZRT1和ZRT2在MFS处理下的显著上调，证实锌转运系统是热带念珠菌应对MFS应激的重要适应性机制。

**结论与讨论**
本研究综合表型和转录组数据，明确了MFS通过下调毒力相关基因（黏附素、菌丝调控因子、念珠菌素等）抑制白色念珠菌和热带念珠菌的生长、菌丝形成和生物膜形成。同时，MFS处理显著上调了锌载体蛋白PRA1和锌转运蛋白ZRT1、ZRT2的表达，补锌实验证实锌可用性增强了真菌在MFS下的存活能力，提示锌代谢参与真菌对MFS的应激适应。MFS对细胞壁几丁质和壳聚糖暴露的扰动以及RNA-seq中核糖体和翻译机制的下调，表明其作用机制涉及多靶点。此外，RNA-seq还发现鞘脂生物合成基因（CTRG_04131及CTRG_00329）的富集，提示MFS可能影响鞘脂稳态。本研究的局限性包括：未进行细胞壁成分的生化定量验证、RNA-seq生物学重复数量有限、未测试多个分离株。结论：MFS抑制真菌生长、酵母菌向菌丝转变和生物膜形成，与毒力因子和生物膜形成相关基因的下调相关联；其作用还涉及锌获取机制（特别是PRA1、ZRT1和ZRT2）的显著上调，扩展了先前关于线粒体损伤和活性氧诱导凋亡的认识，为MFS作为抗真菌药物再利用提供了新的分子依据。