vacidobactin A诱导的铁饥饿抑制缺乏pyoverdine的铜绿假单胞菌生长

《Microbiology Spectrum》：Iron starvation induced by vacidobactin A impairs the growth of pyoverdine-deficient Pseudomonas aeruginosa

　　

摘要翻译：铁获取是细菌存活的关键步骤，塑造细菌在微生物群落中的适应性和生态相互作用。铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）作为一种机会性临床与环境细菌，依赖高亲和力铁载体（siderophore）如pyoverdine来获取铁。理解这些途径可为铁载体特异性、细菌资源竞争和细菌铁代谢提供重要见解。研究人员在此报道vacidobactin A（VacA），一种由土壤细菌Variovorax paradoxus产生的铁载体，通过针对临床多重耐药铜绿假单胞菌菌株的天然产物提取物筛选而鉴定。VacA并非作为直接抗菌剂发挥作用，而是通过施加铁饥饿来损害铜绿假单胞菌的生长。这一现象仅在无法产生其内源铁载体pyoverdine的菌株中观察到。为确定VacA介导的抑制是否源于铁获取受限，研究人员在pyoverdine和pyochelin缺陷型铜绿假单胞菌菌株中异源表达了来自V. paradoxus的TonB依赖性转运蛋白（TonB-dependent transporter）。转运蛋白表达使细菌能够利用VacA结合的铁并恢复生长，证明VacA的拮抗效应由选择性铁载体识别和摄取而非单纯的铁螯合所调控。此外，VacA与硫链丝菌素（thiostrepton）具有协同作用，后者通过劫持pyoverdine受体进入细胞并抑制蛋白质合成。本研究展示了环境微生物如何利用铁载体特异性竞争铁，并在微生物群落中建立拮抗关系。

**研究背景与意义**

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一种多才多艺的革兰氏阴性细菌，广泛分布于土壤、水生生态系统及人体组织等多种生态位，是一种重要的机会性病原体。其固有的抗生素耐药机制——包括通透性较低的外膜、多种广谱外排泵、抗生素降解酶、通过水平基因转移获取耐药基因的能力以及形成耐药生物膜的能力——共同限制了有效抗生素治疗的选择。尽管耐药铜绿假单胞菌的流行率不断上升，针对该病原体的抗菌药物研发管线仍严重不足。在近期世界卫生组织报告中所述的临床或临床前开发阶段的抗菌药物中，具有抗铜绿假单胞菌活性的药物寥寥无几，而曾被视为有前景的假单胞菌特异性抗生素murepavadin因肾毒性在III期临床试验中被终止。因此，发现新的抗铜绿假单胞菌策略迫在眉睫。

微生物产生的天然产物是抗菌化学物质的重要来源。环境微生物尤其以产生大量天然产物而著称，包括铁载体（siderophore）——一类用于螯合铁等必需资源或通过代谢拮抗抑制竞争者生长的生物活性分子。由于铜绿假单胞菌天然栖息于复杂、竞争激烈的环境，其持续面临来自其他土壤和水生微生物的选择压力。研究人员通过针对临床多重耐药（multi-drug-resistant, MDR）铜绿假单胞菌菌株的天然产物提取物筛选，鉴定出一种vacidobactin家族铁载体，命名为vacidobactin A（VacA），并证明其通过深刻干扰铁稳态来抑制铜绿假单胞菌增殖。

**主要技术方法概述**

研究人员从加拿大汉密尔顿土壤样本中分离环境细菌，采用生物活性引导的分离纯化方法从Variovorax paradoxus MST127发酵液中获得VacA；运用高分辨质谱（HR-ESI-MS）、核磁共振波谱（NMR）及Marfey分析确定其化学结构和氨基酸立体化学；借助antiSMASH分析全基因组序列以鉴定其生物合成基因簇（BGC）；通过微量肉汤稀释法测定最低抑菌浓度（MIC）；利用转座子突变体库筛选和基因敲除构建pyoverdine/pyochelin缺陷株及受体突变株；采用荧光竞争实验评估铁载体间铁亲和力；构建FiuA-V. paradoxus嵌合TonB依赖性转运蛋白进行异源表达；并采用棋盘微量稀释法进行联合药敏实验。

**主要研究结果**

**一、从环境细菌中鉴定VacA**

研究人员对来自安大略省汉密尔顿土壤样本的300余份环境细菌甲醇提取物进行筛选，发现一份编号MST127的提取物对临床MDR铜绿假单胞菌C0292具有活性。经16S rRNA和全基因组测序，MST127被鉴定为β变形菌纲菌株Variovorax paradoxus。通过生物活性引导纯化获得活性化合物，高分辨质谱显示其m/z为752.3320 [M+H]⁺，与分子式C₃₀H₄₉N₇O₁₅相符。Chrome Azurol S（CAS）实验提示其具有铁螯合功能。通过一维和二维NMR结合高分辨串联质谱确定其结构为环状缩肽，由五个氨基酸和3-羟基丁酸组成，含有罕见的N端4-氨基-3-羟基-7-(N-羟基甲酰胺基)-2-甲基庚酸残基及β-羟基天冬氨酸（β-OHAsp）和N-羟基鸟氨酸螯合基团。经与参考菌株V. paradoxus DSM 30334产生的vacidobactin A进行对比分析，证实先前报道的vacidobactin A结构中丝氨酸和苏氨酸位置存在错误归属，研究人员鉴定的化合物即为结构修正后的vacidobactin A。antiSMASH分析鉴定出包含聚酮合酶（PKS）和非核糖体肽合成酶（NRPS）组件的推定的vacidobactin BGC，包含五个核心基因、七个模块。

**二、VacA对选定细菌菌株的抗菌活性谱**

在阳离子调节Mueller-Hinton肉汤（CAMHB）中，VacA对来自临床分离的铜绿假单胞菌菌株（C0063、C0307、C0222、C0157、C0166、C0292、C0090和C0060）表现出抗菌活性，MIC值为4–32 μg/mL；而其他铜绿假单胞菌菌株（包括标准菌株PAO1和PA14）、鲍曼不动杆菌和肺炎克雷伯菌对VacA不敏感（MIC > 128 μg/mL）。时间-杀菌动力学研究表明，VacA在5×MIC浓度下处理敏感的铜绿假单胞菌C0060时，与预处理水平相比菌落形成单位（CFU）增加约2个log₁₀，但明显低于未处理对照的生长水平。基于光密度（OD）的18小时生长曲线进一步证实了VacA的生长抑制效应，与铁载体通过限制铁供应发挥抗菌作用的方式一致。

**三、VacA通过铁饥饿抑制pyoverdine缺陷型铜绿假单胞菌**

在铁限制的M9最小培养基（约0.6 μM Fe³⁺）中，VacA对铜绿假单胞菌C0060的MIC为8 μg/mL；当添加10 μM和20 μM FeCl₃时MIC分别升高至16 μg/mL和32 μg/mL，添加30 μM和40 μM FeCl₃时MIC > 128 μg/mL，表明铁补充可浓度依赖性地逆转VacA的抑制活性。利用PA14转座子突变体库筛选发现，pvdA（pyoverdine生物合成必需基因）和fpvA（主要pyoverdine受体）的插入突变使菌株对VacA敏感。外源添加pyoverdine或以pyoverdine与VacA联合处理可恢复突变株生长。荧光竞争实验显示，pyoverdine结合Fe³⁺后其内在荧光被淬灭，而VacA能以浓度依赖方式恢复pyoverdine荧光，证实VacA可与pyoverdine竞争Fe³⁺；但接近完全的荧光恢复需要显著摩尔过量的VacA（200 μM VacA仅恢复约90%–95%荧光），表明pyoverdine对铁的结合竞争力强于VacA。这解释了为何pyoverdine产生菌株对VacA的敏感性较低，以及外源pyoverdine可通过竞争铁而拯救敏感菌株。在一组临床分离菌株中，多数菌株产生大量pyoverdine，而部分菌株荧光极低或缺失（指示pyoverdine生物合成受损或缺如），这些菌株恰对VacA敏感。

**四、在PA14 ΔpvdA ΔpchA中表达V. paradoxus的TonB依赖性转运蛋白可实现VacA依赖性铁摄取**

V. paradoxus MST127的vac BGC编码一个预测的TonB依赖性转运蛋白。铜绿假单胞菌PA14的ferrichrome转运蛋白FiuA与该推定转运蛋白的氨基酸序列一致性为40%。由于全长V. paradoxus转运蛋白无法在铁载体缺陷突变株中功能性表达，研究人员构建了将FiuA N端（含TonB box）与V. paradoxus转运蛋白桶状/栓状结构域融合的嵌合转运蛋白N-FiuA-MST127，并以阿拉伯糖诱导型质粒pHERD20T在PA14 ΔpvdA ΔpchA（无法合成pyoverdine和pyochelin）中表达。MIC实验表明，携带空载体pHRD20T和pHRD20T-fiuA（全长FiuA）的对照菌株对VacA敏感（MIC 16 μg/mL），而表达嵌合转运蛋白N-FiuA-MST127的菌株对VacA不敏感（MIC > 128 μg/mL），证明该转运蛋白可介导VacA-Fe³⁺复合物的摄取并恢复细菌在铁限制条件下的生长。

**五、VacA增强硫链丝菌素对铜绿假单胞菌的活性**

既往研究显示铁饥饿可诱导pyoverdine受体FpvA/FpvB表达，这些受体可意外促进大分子且通常不透膜的抗生素（如硫链丝菌素）进入细胞。棋盘协同实验显示，VacA与硫链丝菌素对测试的全部铜绿假单胞菌菌株（包括标准株PAO1、PA14和临床分离株）均表现出协同抗菌作用，其中pyoverdine产生菌株（C0062、C0030）的协同作用尤为显著，非产生菌株（C0060、C0090）的协同作用较弱。分级抑菌浓度指数（FICI）值范围为0.0195至0.5039。此外，VacA（8 μg/mL）与硫链丝菌素（0.5 μg/mL）联合使用可显著抑制21株临床铜绿假单胞菌分离株的生长。

**六、VacA增强pyoverdine产生并增加受体可用性以促进硫链丝菌素摄取**

为评估VacA对pyoverdine产生的影响，研究人员以VacA（8 μg/mL）、硫链丝菌素（0.5 μg/mL）或其组合处理PA14。结果显示VacA单独处理显著降低生长（OD₆₀₀约为对照的一半），且VacA单独处理明显诱导pyoverdine合成，而硫链丝菌素无此效应。推测机制为：ferripyoverdine与受体FpvA结合激活外细胞质功能（ECF）σ因子PvdS，协同上调pyoverdine生物合成基因和fpvA表达，形成正反馈调节环，从而增加FpvA受体丰度，促进硫链丝菌素摄取。通过比较PA14野生型、受体单敲除突变株（ΔfpvA、ΔfpvB）、双敲除突变株（ΔfpvAΔfpvB）及回补菌株在不同VacA浓度下的生长反应，发现ΔfpvAΔfpvB几乎完全被抑制，ΔfpvA在VacA存在下生长严重受损，而ΔfpvB与野生型相似；在ΔfpvAΔfpvB背景下回补FpvA可恢复VacA敏感性。ΔfpvA突变株的pyoverdine水平低于野生型，提示低水平pyoverdine结合低效摄取系统导致VacA敏感性。ΔfpvA和ΔfpvB突变株在VacA处理下均以浓度依赖方式增加pyoverdine产生。协同实验中，ΔfpvA和ΔfpvB单突变株与亲本PA14对VacA-硫链丝菌素组合表现出相似的敏感性，而双敲除株中未观察到协同作用；抑制ΔfpvB突变株需要比ΔfpvA高2–4倍的硫链丝菌素浓度，提示硫链丝菌素更倾向于通过FpvB受体摄取。

**讨论与结论**

本研究表明，环境菌V. paradoxus产生的VacA通过铁饥饿损害pyoverdine缺陷型铜绿假单胞菌的生长，并与大环硫肽类抗生素硫链丝菌素在广泛的铜绿假单胞菌菌株中展现协同抗菌作用，且与pyoverdine产生状态无关。VacA最初由Johnson等人从V. paradoxus S110中分离表征，但未报道抗菌活性，可能因其对常用筛选菌株PAO1和PA14无活性；而研究人员以不产生pyoverdine的临床MDR菌株C0292为筛选靶标发现了其活性。临床中pyoverdine缺陷型铜绿假单胞菌并不少见，尤其在慢性感染（如囊性纤维化肺感染）中，约30%的CF分离株pyoverdine产生减少或缺失。这凸显了临床分离株遗传多样性的影响以及指示菌株选择在抗菌药物发现中的关键作用——针对表型更多样化的菌株组合进行筛选，可发现标准实验室参考菌株无法揭示的活性。基于参考菌株DSM 30334的对比分析，研究人员对VacA结构进行了修正，纠正了先前报道中丝氨酸和苏氨酸残基的错误位置，强调天然产物研究中严格结构验证的重要性。

VacA的抑制活性源于竞争性铁螯合：铁补充可剂量依赖地逆转抑制，外源pyoverdine可恢复生长。pyoverdine对Fe³⁺的亲和力极高（Ka ≈ 10³² M^-1），远超VacA；pyochelin（Ka ≈ 10⁵ M^-1）则太弱无法有效竞争。研究人员使用ΔpvdA ΔpchA双敲除株排除了残余铁载体的干扰。异源表达V. paradoxus的TonB依赖性转运蛋白可在pyoverdine/pyochelin双缺陷背景下恢复VacA存在条件下的生长，证实VacA活性依赖于转运蛋白特异性的铁摄取，而非使铁普遍不可获得。

铁载体及其受体系统可被多种抗菌天然产物以“特洛伊木马”方式利用。铁螯合剂通过诱导铁限制条件上调相关铁载体受体表达，从而增强此类抗生素的作用。值得注意的是，VacA与硫链丝菌素的协同活性强于既往研究中其他铁载体的组合，且协同作用在营养丰富的Mueller-Hinton肉汤中也能保持，而其他研究需在铁限制条件下进行。这种策略也可能适用于其他依赖铁载体受体的抗生素（如头孢地尔cefiderocol）。总而言之，VacA通过选择性铁载体识别与摄取机制破坏铜绿假单胞菌的铁稳态，在pyoverdine缺陷株中造成严重铁限制而抑制生长，在野生型菌株中则触发强烈的铁饥饿反应并增加受体表达，从而与硫链丝菌素产生协同效应。本研究阐明了铁载体介导的拮抗作用如何干扰铁稳态并触发环境依赖性生理重塑，深化了对复杂微生物群落中竞争性相互作用的理解，并揭示了代谢应激反应可产生可利用的细胞脆弱性。相关成果发表于《Microbiology Spectrum》。