《Cardiovascular Research》：Cytokine-associated ROS and Ca2+ dysregulation in severe inflammatory cardiomyopathy
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摘要
目的：炎症性心肌病（iCMP）是心力衰竭的主要原因之一，目前治疗选择有限。过量的细胞因子水平与不良结局相关，但其在iCMP中的病理机制尚不明确。研究人员旨在识别参与重症iCMP的关键细胞因子，并阐明其对心肌细胞损伤的潜在贡献。
方法与结果：研究人员分
摘要
目的：炎症性心肌病（iCMP）是心力衰竭的主要原因之一，目前治疗选择有限。过量的细胞因子水平与不良结局相关，但其在iCMP中的病理机制尚不明确。研究人员旨在识别参与重症iCMP的关键细胞因子，并阐明其对心肌细胞损伤的潜在贡献。
方法与结果：研究人员分析了经活检证实为重症iCMP的患者（n = 63；左心室射血分数（LVEF）≤ 35%）的细胞因子，并在全国性队列（n = 425）中进行了验证。体外实验检测了重症iCMP中观察到的主要细胞因子对诱导性人多能干细胞来源的心肌细胞（iPSC-CMs）和人主动脉内皮细胞（HAECs）中活性氧（ROS）产生及钙稳态的影响。三种蛋白质（COLEC-12、CRIM-1、IL-6）与重症iCMP相关。在iPSC-CMs中，这些蛋白质增加了ROS（H2DCFDA检测）和细胞内Ca2+水平（Fluo-4AM检测），表明细胞应激。在HAEC中效应较弱。最后，来自电子病历的真实世界数据提示，临床上可用的靶向这些细胞因子的抑制剂可能具有心脏保护作用，尽管这些发现仍属探索性，需在受控研究中加以确认。
结论：COLEC-12、CRIM-1和IL-6在重症iCMP中升高，并在培养的心肌细胞中诱导氧化应激和钙调节紊乱。这些发现强调了它们作为未来潜在治疗靶点的可能性。
临床试验编号：ClinicalTrials.gov标识符：NCT04265040，NCT02187263
论文解读
**一、研究背景与目的**
炎症性心肌病（iCMP）是青壮年心源性猝死（SCD）的主要原因之一。尽管其具有潜在的破坏性结局并构成重大公共卫生负担，但iCMP的病理生理学机制仍未完全阐明，且常被漏诊，导致许多患者治疗效果不佳并给医疗系统带来高昂成本。二十多年来，iCMP的药物开发进展甚微，糖皮质激素仍是重症病例治疗的主要手段。然而，糖皮质激素是非特异性治疗，可能产生严重的副作用，因此亟需更好的治疗方案。部分病毒阴性的慢性iCMP患者对泼尼松和硫唑嘌呤的免疫抑制治疗无应答。
近年来，炎症在各种病因心力衰竭中的作用日益受到关注。人们逐渐认识到，全身性炎症状态，尤其是在iCMP中，可能导致左心室射血分数（LVEF）下降。基于此，研究人员假设iCMP背景下某些细胞因子可能导致心肌损伤，进而引起LVEF降低。探究与iCMP重症临床病程相关的细胞因子，有助于识别新的药物靶点，未来可通过单克隆抗体进行阻断，或通过过滤或免疫吸附进行清除。本研究分析了两组患者队列，本机构队列（DHZC）仅包含经活检证实的iCMP患者，全国性队列还纳入了基于心脏磁共振成像（CMR）诊断的患者。根据LVEF 35%为界，将患者分为重症iCMP组（LVEF ≤ 35%）和轻中度iCMP组（LVEF > 35%）。随后在细胞培养中测试所识别的蛋白质对诱导性人多能干细胞来源的心肌细胞（iPSC-CMs）和人主动脉内皮细胞（HAECs）的潜在有害效应。最后，利用电子病历（EMRs）的真实世界数据，探索性分析临床上使用的针对这些细胞因子的抑制剂是否与心脏损伤血液标志物降低相关，以提示可能的心脏保护效应。
**二、主要技术方法**
研究人员利用Olink邻位延伸分析（PEA）技术对患者血浆样本进行细胞因子分析，使用Olink Explore 384炎症亚组检测。细胞因子与LVEF的关联采用线性回归模型分析，并以错误发现率（FDR）进行多重检验校正。体外功能实验在iPSC-CMs和HAECs中进行，使用H2DCFDA检测试剂盒评估活性氧（ROS）产生，使用Fluo-4AM试剂盒定性分析细胞内钙离子水平变化。此外，研究人员从柏林Charité大学医学院三个风湿病科室的电子病历中提取数据，评估接受IL-6或Janus激酶抑制剂治疗前后患者高敏肌钙蛋白T（hs-TnT）和N末端前脑钠肽（NT-proBNP）水平的变化。DHZC队列样本来自2014年至2021年间收治的63例患者，全国性队列（TORCH注册研究）包含来自德国11个中心的425例患者。
**三、研究结果**
1. **研究人群**：研究共纳入488例iCMP患者（DHZC队列63例，全国队列425例），并分析了836例患者的临床数据以及348例患者的EMR数据。两组队列在性别、年龄、体质指数（BMI）、LVEF和肾功能等关键基线特征上无显著差异。约三分之一的参与者为女性，中位年龄49-54岁，中位BMI约26-27 kg/m2，提示平均超重。36.5%的DHZC队列和39.8%的全国队列患者表现为重度左心功能不全（LVEF ≤ 35%）。
2. **DHZC队列中的细胞因子分析**：在DHZC队列（n = 63）中，采用线性回归模型分析细胞因子水平与LVEF的关系。经多重检验校正后，发现五种细胞因子与LVEF显著相关（FDR < 0.05）。细胞因子相对浓度与LVEF呈反比关系，即较高的细胞因子浓度与较低的LVEF相关。
3. **独立全国队列中的结果验证**：利用TORCH注册研究中的独立队列（n = 425）对DHZC队列结果进行验证。经过标准化处理和数据整合后，DHZC队列中识别的五种细胞因子中有四种在全国队列中得到重复验证。尤其值得注意的是，COLEC-12在DHZC队列中与LVEF关联排名第6位（P = 2.19×10
-5，FDR = 0.08），但在全国队列中上升为排名第一的细胞因子（P = 4.46×10
-16，FDR = 1.64×10
-13）。总体而言，共有77种细胞因子与LVEF显著相关（FDR < 0.05）。在两个队列合并分析中（n = 488），COLEC12、PLAUR、AGRN、WNT9A、LAIR1、LILRB4、FABP1、CRIM1、CCL3、FSTL3等位列与低LVEF相关的前10位细胞因子，其关联均具有高度统计学显著性（FDR < 2.9×10
-11）。
4. **所选细胞因子对iPSC-CMs和HAECs的体外效应**：基于生物学合理性和在先文献中的支持，选择COLEC-12、CRIM-1和IL-6进行功能测试。实验所用细胞因子浓度对应重症iPSC-CMs队列中的平均浓度。在iPSC-CMs中，与未处理对照（基线）相比，每种细胞因子在暴露24小时和48小时后均显著增加ROS产生。COLEC-12诱导的ROS反应最强，24小时时较对照增加8.5倍（标准差SD 0.45），48小时时仍维持6.1倍（SD 0.76）的升高。IL-6紧随其后，24小时时增加8.3倍（SD 0.50），48小时时达到8.7倍（SD 1.48）。CRIM-1在24小时时诱导峰值增加7.0倍（SD 2.01），48小时后降至6.5倍（SD 0.66）。在HAECs中，所有细胞因子在暴露24小时和48小时后也均显示ROS显著增加，但效应总体弱于iPSC-CMs。在钙摄取实验中，iPSC-CMs经三种细胞因子处理后24小时出现轻微反应，但COLEC-12和CRIM-1处理48小时后出现强烈的荧光活性，而IL-6处理组则恢复至接近基线水平。在HAECs中，24小时内各处理组无明显视觉增强，48小时后IL-6和COLEC-12表现出轻微反应。
5. **EMR真实世界数据探索性评估**：研究人员筛选了柏林Charité大学三个风湿病科室的18,566份患者记录，其中8,767例患者有hs-TnT和/或NT-proBNP测量记录，348例患者曾接受针对本研究主要细胞因子的特异性抑制剂治疗（包括IL-6抑制剂和Janus激酶抑制剂）。结果显示，接受IL-6受体抑制剂治疗的患者，其匹配队列中位NT-proBNP水平显著降低216 ng/L（n = 76；P < 0.001），配对样本分析也显示显著降低95 ng/L（n = 40；P = 0.005）。接受Janus激酶抑制剂治疗的患者，其匹配队列中位NT-proBNP水平显著降低约216 ng/L（n = 97；P < 0.001），hs-TnT水平显著降低16 ng/L（n = 53；P < 0.001）；配对样本分析也分别显示NT-proBNP显著降低45 ng/L（n = 44；P = 0.045）和hs-TnT显著降低8.5 ng/L（n = 12；P = 0.028）。在调整年龄、性别、肾功能不全、心力衰竭、风湿性和自身免疫性合并症后，这些关联仍然显著。
**四、讨论与结论**
讨论部分指出，本研究通过在两个独立队列中进行细胞因子谱分析，成功识别了与重症iCMP相关的多种蛋白质，并验证了较高细胞因子水平与LVEF降低之间的负相关关系。IL-6作为已知的心血管炎症因子，其与重症iCMP的关联以及对心肌细胞和内皮细胞的ROS诱导效应与既往研究一致。研究新发现了COLEC-12和CRIM-1在iCMP中的作用，COLEC-12诱导ROS和破坏心肌细胞钙稳态的发现属首次报道，CRIM-1则可能通过ROS诱导和钙稳态失衡参与重症心力衰竭的病理机制。此外，FSTL3和LGALS9也被发现与iCMP严重程度相关。对真实世界EMR数据的探索性分析显示，临床可用的IL-6或Janus激酶抑制剂可能与NT-proBNP和hs-TnT水平降低相关，提示潜在的心脏保护效应，但该结果受限于适应症偏倚和残余混杂因素，需谨慎解读并通过进一步研究验证。
研究结论为：研究人员验证了重症iCMP患者中特定细胞因子过量可能促进心脏损伤并导致LVEF降低的假设。共有77种蛋白质在重症iCMP患者中升高，且较高的细胞因子水平与LVEF降低相关，该结果具有统计学显著性，并在外部全国多中心队列（n = 435）中得到验证。基于生物学合理性和文献支持，选择COLEC-12、CRIM-1和IL-6三种主要升高的蛋白质进行机制研究。当以重症iCMP队列中观察到的浓度将这些细胞因子应用于iPSC-CMs和HAECs时，观察到氧化应激增加和钙调节紊乱，尤其是在iPSC-CMs中，这与可能加剧心功能障碍的贡献一致。探索性EMR分析的真实世界数据提示，已用于其他炎症性疾病的靶向这些细胞因子或其下游信号通路的抑制剂可能具有心脏保护效应。这些发现与假设一致，但仍需进一步验证。部分识别的细胞因子此前已被报道为炎症性心肌病和心力衰竭的潜在治疗靶点，支持了研究结果的生物学合理性。此外，研究还发现了多个新的潜在靶点，可通过结合中和剂、过滤、免疫吸附或现有药物再利用等策略进行干预，这对于当前标准治疗效果不佳的患者可能具有潜在意义。
