野火灰与道路盐的共同暴露重塑两栖动物皮肤及肠道微生物群并降低其适合度

《Environmental Research》：Combined Exposure to Wildfire Ash and Road Salts Reshapes Skin and Gut Microbiota and Reduces Fitness in Amphibians

　　

摘要

日益增加的野火风险和持续的冬季道路维护，增加了野火灰烬和道路融雪盐通过降雨或融雪径流进入寒区两栖动物繁殖栖息地的潜在风险，但二者共同作用于皮肤和肠道微生物组的效果仍不清楚。本研究将大蟾蜍蝌蚪暴露于对照组（C）、低温道路盐（D）、环保型道路盐（H）、野火灰烬水提液（T）、T+D（TD）和T+H（TH）条件下28天。采用16S rRNA基因测序分析皮肤和肠道微生物组。结果显示，暴露导致体重、发育比例和存活率下降，其中T+H条件下体重和存活率下降最为显著。暴露增加了微生物失调指数（MDI），且皮肤和肠道MDI分别与存活率和发育比例呈负相关。双因素模型和置换多元方差分析（PERMANOVA）揭示了微生物组alpha和beta多样性的交互效应，协同降低主要发生在肠道alpha多样性方面。非度量多维标度（NMDS）、冗余分析（RDA）和典范对应分析（CCA）表明，野火灰烬水提液在微生物组重构中占据显著主导地位。基于β最近分类单元指数（βNTI）的进一步分析显示，肠道微生物组装过程也发生了变化。总体而言，野火灰烬水提液和道路盐的单一及联合暴露均可损害蝌蚪适应性并扰乱皮肤和肠道微生物组稳态。本研究为评估寒区繁殖栖息地中野火灰烬径流与道路盐输入并存条件下两栖动物的风险提供了证据。

引言

大规模的两栖动物衰退可能破坏生态系统功能、改变疾病相关的生态过程、削弱农业可持续性并加速生物多样性丧失（Becker等，2023；Macdonald等，2023）。日益加剧的人类活动、栖息地退化、蛙壶菌病和气候变化已成为两栖动物衰退和灭绝风险的主要驱动力（Ferrante等，2025；Kupferberg等，2022；Yang等，2022）。重金属、工业化学品、农药和药物残留可能在径流中共存，导致复合污染，从而破坏两栖动物栖息地，损害其繁殖、发育和免疫功能，并导致种群衰退（Najibzadeh等，2024；Punniyakotti等，2024；Rathi等，2021）。两栖动物的皮肤和肠道微生物组构成重要的生物屏障，参与抗菌防御、免疫调节和代谢解毒（Dong等，2024；Zhu等，2024）。皮肤作为生态免疫防御的第一道防线，而肠道则辅助消化和营养吸收、调节免疫并抑制病原体（Gou等，2022；Siomko等，2023）。阐明污染如何重塑这些微生物组并破坏宿主-微生物稳态，对于评估生态损害和两栖动物健康风险具有重要意义（Long等，2024）。

野火频率的增加和道路盐的广泛使用对两栖动物及其栖息地构成了长期威胁（Ocampo等，2022；Xu等，2024）。过去二十年来，全球变暖使极端野火的频率和严重程度几乎翻了一番（Cunningham等，2024；Dosiou等，2024；Gomez Isaza等，2022）。仅在2023年，全球野火就烧毁了超过3.84亿公顷土地（Kolden等，2024）。野火可破坏支持两栖动物和人类社会的森林、湿地和草原（Hossack和Pilliod，2011）。野火产生的污染物可损害两栖动物的呼吸和内分泌系统，降低水和土壤质量，并破坏植被和食物网（Xu等，2024）。野火后的降雨可将灰烬径流输送至淡水生态系统，改变光照、温度和含氧量，加剧水生生物的生理应激，并改变物种分布和社区组成（Gomez Isaza等，2022）。道路盐的使用是寒冷和高纬度地区普遍存在的人为胁迫因子，每年有数千万吨道路盐用于维护冬季交通安全（Reihanifar和Naimi，2018；R?dland等，2020）。道路盐径流增加盐度，扰乱渗透调节和胚胎发育，损害养分循环，并在沉积物中持续存在（Hintz和Relyea，2019；Szklarek等，2022）。对于两栖动物，暴露于道路盐可改变迁徙和繁殖行为，增加蝌蚪应激水平，降低存活率和繁殖能力，并诱导发育缺陷和病原体易感性（Brady等，2022）。然而，野火灰烬和道路盐对水生生态系统和两栖动物的共同效应仍知之甚少。

野火灰烬和道路盐等环境胁迫因子可通过扰乱皮肤和肠道微生物组损害两栖动物健康（Xu等，2024）。野火灰烬可能含有金属和有机污染物，可能改变皮肤微环境，抑制有益微生物，并诱导氧化应激和炎症，从而破坏皮肤屏障并增加病原体易感性（Fernandez-Marcos，2022；Ré等，2021）。当蝌蚪摄食灰烬浸出物或颗粒物，或通过鳃吸收溶解的灰烬成分时，这些物质可能扰乱肠道微生物组，减少有益菌数量，并损害免疫功能和营养吸收（Xu等，2024）。道路盐可增加盐度，抑制有益微生物，损害屏障功能，并扰乱渗透调节、代谢、免疫功能和肠道营养吸收（Hintz和Relyea，2019；Schuler和Relyea，2018）。在联合暴露条件下，野火灰烬和道路盐可能通过改变水质化学特性、增加渗透应激并破坏宿主生理稳态，协同加剧微生物失调（Li等，2023；Xu等，2024）。灰烬衍生的氧化应激和盐诱导的离子应激可能进一步抑制有益微生物并改变宿主相关微生物生态位，从而损害两栖动物健康并降低其适应能力（Rao和Parsai，2025）。确定这些胁迫因子是否产生交互作用，以及在联合暴露条件下是否有一种因子发挥更强的结构化影响，对于预测微生物组介导的健康风险和制定针对来源的缓解策略具有重要意义（Hernández-Gómez和Hua，2023）。然而，野火灰烬和道路盐对两栖动物皮肤和肠道微生物组的单独及联合效应仍知之甚少，特别是在微生物失调、位点特异性多样性响应、社区重构和生态组装过程方面。

东北蟾蜍是一种分布于东北亚的蟾蜍，包括俄罗斯远东地区、朝鲜半岛和中国东北地区。该物种对环境变化敏感（Tong等，2020）。它在静水或缓流水域中繁殖，包括池塘、湿地、沟渠和河流深水区，其蝌蚪与水生环境紧密关联（Xu等，2024）。通过摄食藻类、生物膜和碎屑，蝌蚪参与水生食物网过程和有机质循环，将水传播的污染物暴露与蝌蚪发育、两栖动物补充和生态系统过程联系起来（Rowland等，2023）。在中国东北地区，野火灰烬和道路盐可能通过降雨或融雪径流被输送至这些淡水繁殖栖息地，形成涉及灰烬浸出物和盐富集径流的环境相关暴露场景（Dugan和Arnott，2023；Gomez Isaza等，2022；Tong等，2023）。在蝌蚪阶段，皮肤可能反映对周围水体中溶解污染物的直接响应，而肠道则通过摄食、饮水和颗粒相关摄取途径产生响应（Coelho等，2022；Szeligowski等，2022）。因此，本研究采用16S rRNA基因测序评估野火灰烬水提液和道路盐对东北蟾蜍蝌蚪适应性、皮肤微生物组和肠道微生物组的单独及联合效应。我们假设：（1）野火灰烬水提液和道路盐将损害蝌蚪适应性并扰乱皮肤和肠道微生物组稳态，且联合暴露下损害更强；（2）野火灰烬水提液和道路盐将交互重塑皮肤和肠道微生物组，且灰烬水提液在联合暴露条件下可能占据主导作用；（3）灰烬-盐暴露将改变皮肤和肠道微生物组及其生态组装过程。

样本采集与实验材料

成年东北蟾蜍雄性和雌性个体采集于中国黑龙江省萝北县的一个冬眠池塘（47.5789°N，130.3794°E），并运送至佳木斯大学实验室。所有动物实验程序均经佳木斯大学机构动物护理和使用委员会批准（IACUC #2020-035）。所有成年蟾蜍均健康，表现出正常的形态和行为。随着环境温度的下降，蟾蜍在11月停止进食。其平均体重……

暴露溶液的理化特性

各处理组暴露溶液的理化性质表现出描述性差异（表S1）。含盐处理组（D、TD、H和TH）的Na、Cl、TDS和盐度数值高于C和T组。在所测离子中，Ca、K、Mg和Na在TD组中浓度最高（分别为75.867、154.462、56.677和655.133 mg/L），而Cl在TH组中浓度最高（665.129 mg/L）。在各理化指标中……

宿主适应性受损与蝌蚪补充的意义

野火灰烬水提液和道路盐通过降低体重、存活率和发育比例损害蝌蚪适应性，其中体重和存活率的降幅在联合暴露条件下最为显著，尤其在TH组（图1A）。这些结果表明，灰烬-盐径流可对两栖动物幼体施加致死和亚致死成本（Ocampo等，2022）。在单一胁迫因子暴露下，野火灰烬水提液主要产生亚致死性生长成本，因为T组……

结论

本研究表明，野火灰烬水提液和两种道路盐（低温道路盐和环保型道路盐）的单一及联合暴露均可通过耦合蝌蚪适应性丧失与宿主相关微生物组稳态破坏来损害东北蟾蜍蝌蚪。这些效应包括致死和亚致死成本，将两栖动物风险从短期蝌蚪毒性扩展到通过减少蝌蚪产出和降低个体质量带来的与补充相关的后果。

CRediT作者贡献声明

潘岳亮：软件、数据整理。姜宏新：原稿撰写、验证、数据整理。徐明达：软件。董文静：可视化、数据整理。罗智文：数据整理。崔立永：审稿与编辑、原稿撰写、可视化、软件、项目管理、经费获取。凡秋茹：原稿撰写、可视化、验证、软件、数据整理。童清：审稿与编辑、原稿撰写……

伦理声明

本研究按照ARRIVE（动物研究：体内实验报告）指南进行。本研究经佳木斯大学机构动物护理和使用委员会批准（批准号：IACUC #2020-035）。

伦理批准

本研究符合中国实验动物伦理使用国家指南，并遵循替代（Replacement）、减少（Reduction）和优化（Refinement）3R原则。所有动物在整个研究过程中均得到人道对待。实验方案经佳木斯大学机构动物护理和使用委员会审核并批准（IACUC #2020-035）。

利益冲突

作者声明不存在竞争利益。

数据可用性

本研究产生的序列数据已存入美国国家生物技术信息中心（NCBI）BioProject数据库，登录号如下：PRJNA1050064、PRJNA1050065、PRJNA1058644、PRJNA1058649、PRJNA1112535、PRJNA1113390、PRJNA1113391、PRJNA1113392、PRJNA1113393、PRJNA1113398、PRJNA1113406和PRJNA1113412。

利益冲突声明

? 作者声明不存在可能影响本文所报告工作的已知竞争性财务利益或个人关系。

致谢

本工作受黑龙江省自然科学基金（PL2025C033）、佳木斯市科技计划创新激励项目（NY2025JL0010）、省级科研院所科研业务费（Jfy2025-04）、佳木斯大学基本科研业务费（CXTD202104）和黑龙江省高校基础研究青年人才计划（YQJH2023217）资助。

童清 | 凡秋茹 | 姜宏新 | 潘岳亮 | 董文静 | 徐明达 | 罗智文 | 崔立永
佳木斯大学生物与农业学院，中国佳木斯 154007