亚基依赖的枸杞多糖与麦谷蛋白相互作用机制：基于多光谱技术和分子动力学模拟的见解

《Food Chemistry》：Subunit-dependent interaction mechanisms between Lycium barbarum polysaccharides and glutenin: Insights from multi-spectroscopy and molecular dynamics simulations

　　了解生物活性多糖如何调节单个麦谷蛋白亚基的结构和组装，对于设计谷物基蛋白质体系具有重要意义。本研究利用综合光谱学、色谱学和分子动力学分析，探讨了枸杞多糖（LBP）对高分子量麦谷蛋白亚基（HMW-GS）和低分子量麦谷蛋白亚基（LMW-GS）的影响。添加LBP与HMW-GS聚集增加相关。在5% LBP时，其游离巯基含量从0.86降至0.82 μmol/g，而SDS不溶性蛋白组分从73.00%增至74.52%。相比之下，LMW-GS表现出二级结构有序度降低和疏水性暴露增加；其β-折叠含量从46.00%降至36.67%，同时无规卷曲含量从24.47%增至35.90%。分子动力学分析提供了蛋白质-LBP不同相互作用模式的互补证据，在模拟时间尺度内，HMW-GS观察到更广泛且持久的接触，而LMW-GS则表现为相对局部且动态的接触。重要的是，这些发现表明HMW-GS和LMW-GS对同一种多糖经历不同的结构和组装响应，挑战了将麦谷蛋白视为均一蛋白组分的传统处理方式。通过确定麦谷蛋白亚基身份是影响多糖-蛋白质相互作用的重要因素，本研究为谷物基食品体系中面筋结构的靶向调控提供了亚基分辨框架。小麦面筋是一种复杂的粘弹性蛋白网络，决定了面团弹性、气体保持性和烘焙质量。麦谷蛋白是面筋聚合物强度的主要贡献者，由高分子量麦谷蛋白亚基（HMW-GS）和低分子量麦谷蛋白亚基（LMW-GS）组成（Yang等人，2023a）。HMW-GS（77–160 kDa，约占麦谷蛋白的20%）通过广泛的分子间二硫键形成聚合物骨架，与面团体积和烘焙性能呈正相关（Lagrain等人，2008）。相比之下，LMW-GS（23–68 kDa，约占麦谷蛋白的80%）含有八个半胱氨酸，主要形成链内二硫键，并有助于面团的弹性和延展性（D'Ovidio等人，2004）。除组成差异外，两类亚基表现出不同的分子架构。HMW-GS含有长的重复结构域，具有高构象灵活性和溶剂暴露的半胱氨酸残基，促进了广泛的分子间二硫键交联。相比之下，LMW-GS主要形成链内二硫键。这些内在差异导致对热处理、氧化还原条件、水合和非共价相互作用产生截然不同的构象响应，从而导致不同的聚集途径和网络形成行为（Bouabdellah等人，2025；Du等人，2020；Li等人，2016）。这种结构和功能对比突出了分别研究两种亚基的必要性，特别是在探索外部调节剂或添加剂如何调节麦谷蛋白结构和组装时。此外，尽管目前的发现增进了我们对面筋组装的理解，但大多数现有工作关注的是作为整体复合材料的面筋或混合亚基系统。外部生物大分子影响不同麦谷蛋白亚基构象演化和聚集行为的具体调控机制在很大程度上仍未被探索。蛋白质-多糖相互作用被广泛用于通过氢键、静电吸引、疏水相互作用和空间效应来调节蛋白质的溶解度、构象、聚集和界面性质（Gentile，2020）。据报道，果胶、阿拉伯胶、藻酸盐和阿拉伯木聚糖等多糖会改变蛋白质网络形成、热稳定性、凝胶化和乳化性能（Chen等人，2023；Guldiken等人，2023；Hernández-Espinosa等人，2020）。然而，它们的影响并非普遍稳定。根据分子量、电荷密度、浓度、pH值和蛋白质与多糖比率的不同，多糖可能改善蛋白质水合和胶体稳定性，或通过架桥、电荷屏蔽和竞争性水合作用引起聚集和构象破坏。LBP主要含有阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖和鼠李糖残基，具有丰富的羟基和灵活的支链骨架，有利于与蛋白质相互作用（Liu等人，2022；Wang等人，2024）。既往研究表明，LBP改变了大豆蛋白和乳清蛋白的构象、热稳定性、表面电荷和聚集，尽管响应因蛋白质类型和环境条件而异（Wang等人，2025；Xing等人，2024）。这些可变的结果表明，LBP的影响不能概括适用于所有蛋白质。在面筋体系中，这种不确定性因HMW-GS和LMW-GS的不同分子架构而进一步复杂化，它们通常被视为均一的麦谷蛋白组分。因此，LBP是否与这两类亚基以相同方式相互作用仍未解决。在谷物体系中，水溶性阿拉伯木聚糖（WEAX）和小麦麸皮纤维等多糖通过改变面筋蛋白之间的非共价和共价相互作用平衡，已知会影响面筋聚合、水合动力学和面团流变特性（Li等人，2024；Wang等人，2020）。然而，这些发现未区分HMW-GS和LMW-GS的贡献，也未探索结构异质性多糖如何与这两类麦谷蛋白亚基产生不同的相互作用。关于LBP是否与麦谷蛋白泛化相互作用，或者由于HMW-GS和LMW-GS不同的结构域架构、溶剂可及性和半胱氨酸反应性而导致结构和功能后果根本不同，仍缺乏机制理解。因此，仍存在一个关键的知识空白：LBP影响麦谷蛋白结构和聚集的亚基依赖性机制尚未阐明。我们假设LBP以亚基依赖方式与麦谷蛋白亚基相互作用，在HMW-GS和LMW-GS中诱导不同的构象转变和非共价相互作用模式，从而导致不同的聚集行为。因此，本研究旨在阐明LBP如何调节两种代表性麦谷蛋白亚基-HMW-GS和LMW-GS的结构，以及这些效应是否具有亚基特异性。为此，使用多光谱和色谱分析表征了巯基-二硫键交换、二级和三级结构变化、疏水性、ζ-电位、聚集行为和聚合模式，同时采用全原子MD模拟在原子水平探测构象演化和分子间相互作用。通过整合实验和计算证据，本工作为麦谷蛋白-多糖相互作用的分子调控提供了新见解，并为设计富含生物活性多糖同时保持理想面筋网络质量的谷物基功能产品提供了理论基础。麦谷蛋白亚基的制备和LBP-麦谷蛋白复合物的制备按照修改后的方案分离麦谷蛋白亚基（Ding等人，2024；Liu等人，2023）。将面筋粉（30 g）悬浮于150 mL 50%（v/v）1-丙醇中，搅拌30分钟，然后在4°C下以2500 ×g离心15分钟。提取进行了三次，将三次连续提取循环收集的滤液合并，以便后续分级。为了提高麦谷蛋白溶解度，将合并的提取物调节至60%（v/v）1-丙醇，含1%（w/v）游离巯基(-SH)含量分析如图1a所示，HMW-GS的游离巯基(-SH)含量随LBP浓度增加而逐渐降低。对照组的-SH水平为0.86 μmol/g，添加2% LBP后降至0.83 μmol/g，降幅为4.4%。当LBP浓度增加到5%时，-SH含量进一步降至0.82 μmol/g，相对于对照组降幅为5.5%。相比之下，LMW-GS表现出非线性响应。对照组的-SH含量为讨论HMW-GS和LMW-GS对LBP的不同响应可能与它们的分子架构差异有关。HMW-GS含有延伸的重复中心结构域，富含谷氨酰胺和脯氨酸残基，提供了高构象灵活性、溶剂可及性和多个空间分布的相互作用位点（Li等人，2020）。这种架构可能有助于在LBP和HMW-GS之间形成更广泛且更多价的相互作用界面结论总之，本研究揭示LBP对麦谷蛋白结构组织发挥高度亚基依赖性效应。LBP似乎通过加强分子间相互作用、巩固二级和三级结构以及促进更内聚的聚合物组装形成来促进HMW-GS重组。相比之下，LMW-GS表现出结构有序度破坏、构象灵活性增加和聚集稳定性减弱CRediT作者贡献声明Tao Yang：写作——审阅与编辑，写作——初稿。Hao Zhang：方法学。Yun-ke Gou：形式分析。Yue Zhang：形式分析。Gang Wu：资源。Chen Li：写作——审阅与编辑，验证，监督，项目管理，方法学，形式分析，概念化。利益冲突声明作者声明他们没有任何已知的竞争性经济利益或个人关系可能影响本文报告的工作。致谢本工作得到了陕西省联合校园招聘与人才利用专项计划（K4050425503）、国家小麦育种重点实验室开放项目（WIKF202504）、西北农林科技大学博士科研基金（编号Z1090124051）、海西州科技局（246210625106638）；国家自然科学基金（32272181）；国家自然科学基金（资助号32072350）的一般项目的支持。Tao Yang|Hao Zhang|Yun-ke Gou|Yue Zhang|Gang Wu|Chen Li