受F-3链霉菌分泌组指导的跨家族几丁质酶鸡尾酒重组以实现几丁二糖的高效生产

《Food Chemistry》：Reconstruction of a cross-family chitinase cocktail for efficient chitobiose production guided by the secretome of Streptomyces sp. F-3

　　

•GH18和GH19几丁质酶表现出互补的底物特异性。
•跨家族几丁质酶鸡尾酒（GH18和GH19）克服了单一家族的局限性。
•按照天然分泌化学计量比重建了几丁质酶鸡尾酒。
•FR48鸡尾酒实现了从几丁质到高产几丁二糖的生产。
•本研究提供了一种利用难以降解生物质的通用生物仿生策略。

**引言**

几丁质是一种由β-1,4-连接的N-乙酰-D-葡糖胺组成的线性聚合物，是仅次于纤维素的最丰富的天然多糖（Chen等，2020）。几丁质是海洋无脊椎动物的重要结构组分，估计全球年生物量产量约为3.7×10?公吨，是海洋生物重要的碳和氮来源（Mukherjee和Sen，2006）。然而，几丁质的高度结晶结构阻碍了其高效利用。这种结构稳定性源于高度有序的氢键网络，并进一步受到N-乙酰化程度（DA）和聚合度（DP）的影响（Moussian，2019）。由来自多个糖苷水解酶（GH）家族的多种几丁质降解酶驱动的酶促水解，为几丁质降解提供了替代化学方法的环保途径。在这些家族中，GH18和GH19是两个被广泛研究的参与几丁质去聚合的几丁质酶家族（Lombard等，2014）。这两个家族进化出了不同的整体结构和催化机制：广泛分布的GH18几丁质酶具有(β/α)?桶状折叠结构，采用底物保持机制；而植物中普遍存在的GH19家族则表现出溶菌酶样折叠结构和翻转机制（Orlando等，2021）。尽管GH18和GH19几丁质酶分别采用保持和翻转催化机制，但两者在几丁质水解过程中均可生成几丁寡糖。它们的主要差异在于新生成的还原端处的立体化学结果，而最终产物分布则主要取决于酶的特异性性质，如切割模式、连续催化能力、底物结合结构和底物结构（Horn等，2006；Nakagawa等，2013）。值得注意的是，GH18几丁质酶在降解结晶几丁质方面表现优异，这归功于其延伸的底物结合沟和较强的底物亲和力（Zhao等，2022）。尽管GH18和GH19几丁质酶各自具有催化能力，但这两个家族之间高效降解几丁质的协同潜力在很大程度上仍未被探索。

在自然界中，微生物已进化出复杂的多酶系统以实现几丁质的高效降解（Monge等，2018）。粘质沙雷氏菌产生三种GH18几丁质酶：SmChiC是一种内切几丁质酶，随机切割几丁质链；连续催化型几丁质酶SmChiA和SmChiB分别催化几丁质链还原端和非还原端的切割。尽管SmChiA、SmChiB和SmChiC最终主要从几丁质中产生几丁二糖，仅有少量N-乙酰葡糖胺，但其初始产物谱存在差异。非连续催化型内切几丁质酶SmChiC最初生成较长的几丁寡糖，而连续催化型SmChiA和SmChiB则主要以相反方向降解几丁质链并释放几丁二糖（Horn等，2006）。另一种海洋细菌日本希瓦氏菌编码四种GH18几丁质酶，这些酶在几丁质降解过程中表现出功能多样性和协同效应（Monge等，2018）。这种内切型和连续催化型几丁质酶的自然组合凸显了一种有效的微生物几丁质利用策略，其中内切几丁质酶随机切割几丁质链的内部区域以产生新的可及链端，而连续催化型几丁质酶则持续结合在这些暴露的末端并连续催化 successive 切割事件，从而提高几丁质向几丁寡糖转化效率（Horn等，2006；Unuofin等，2024）。值得注意的是，链霉菌属被确认为GH19几丁质酶的首个非植物来源（Itoh等，2002）。我们之前的工作表明，链霉菌属F-3分泌一种耐热酶系统，其中GH18和GH19几丁质酶协同作用以加速底物水解。SsChi18A、SsChi18B和SsChi19A对胶体几丁质的比活性分别为54.33±0.55、34.74±2.72和5.09±0.83 U/μmol。将SsChi19A与SsChi18A或SsChi18B组合后，30分钟内分别释放约0.40和0.32 mg还原糖，分别比对应单独酶活性的计算总和高出29%和28%（Sun等，2019）。然而，这种协同作用的精确分子基础，特别是每个家族独特的底物特异性如何贡献于其对几丁质的协同效应，仍有待阐明。

几丁质水解的产物，尤其是几丁寡糖，具有重要的生物活性，在食品、制药和农业领域有广泛应用（Jafari等，2020）。特别是，几丁二糖是一种明确定义的几丁寡糖，具有已报道的生物活性和潜在增值应用（Charoenpol等，2024）。在2型糖尿病小鼠中，几丁二糖处理使血糖、总胆固醇和甘油三酯水平分别降低了约20.0%、26.5%和16.1%，同时也在体外保护细胞免受氧化性DNA损伤（Salgaonkar等，2016；Wu等，2017）。为了模拟自然效率，构建多酶鸡尾酒已成为实现几丁质高效转化为几丁二糖的关键途径。近年来，也有人做出了一些努力（表1）。虽然粗酶制剂使用便捷，但发酵液中未定义的代谢物可能影响产品的安全性和一致性。将单一几丁质酶异源表达后在体外重建定义明确的酶鸡尾酒，提供了一种可控策略，可精确调控酶组成和剂量、优化催化性能并提高产品一致性。此外，优化酶比例并结合可扩展的重组酶生产，可能提高定制酶系统在工业化几丁质生物转化中的经济可行性（Mekasha等，2017；Thomas等，2022）。一个代表性实例是由SmChiA-M、SmChiB和SmChiC组成的优化酶鸡尾酒。单独使用时，这些酶分别每克脱蛋白脱脂磷虾粉（DDKP）释放约14.6、10.4和9.1 mg还原糖。经过比例优化后，该鸡尾酒在24小时内从20 g/L DDKP中产生了2.04 g/L几丁二糖，相当于几丁二糖产率约为102 mg/g脱乙酰几丁质（Chu等，2019）。然而，目前仍缺乏优化酶组合和比例的通用理性框架。此外，许多现有酶系统在热稳定性和协同效率方面存在局限。

本研究的目的是开发一种合理设计的跨家族几丁质酶鸡尾酒以实现几丁质的高效生物转化，并阐明GH18和GH19几丁质酶之间的协同机制。为实现这一目标，我们开发了一种分泌组引导的策略来重建跨家族几丁质酶鸡尾酒。以嗜热细菌链霉菌属F-3为模型（该菌的几丁质降解系统此前由我们课题组表征），我们基于三种GH18和一种GH19几丁质酶的分泌概况和化学计量比重建了酶鸡尾酒。由于具有互补的底物结合模式，重建的酶鸡尾酒表现出增强的协同活性和高效的几丁二糖生产。本研究为几丁质增值提供了稳定和高效的酶平台，同时为GH18和GH19几丁质酶之间的协同相互作用提供了机制性见解。

**材料部分摘要**

**材料和试剂**

链霉菌属F-3，一种嗜热几丁质酶产生菌株，分离于中国山东禹城的碱性堆肥环境（Sun等，2016）。α-几丁质购自桑顿（上海，中国），源自蟹壳；β-几丁质购自索莱宝（北京，中国），源自鱿鱼骨。底物壳聚糖和羧甲基纤维素钠（CMC）购自桑顿生物科技（上海，中国）。胶体几丁质由α-几丁质制备。

**链霉菌属F-3的高效几丁质利用**

通过在45°C下以α-几丁质为唯一碳源培养该菌株，评估了链霉菌属F-3的几丁质降解能力。该菌株持续降解α-几丁质达60小时，降解率达34%，上清液中积累还原糖（图1A）。嗜 maltophilia 窄食单胞菌3E在30天内仅实现了约45.9%的蟹壳几丁质降解（Majengbasan等，2025），而链霉菌属F-3的酶系统达到了34%的降解率。

**结论**

在自然界中，几丁质去聚合主要由两个关键几丁质酶家族GH18和GH19介导。在链霉菌属F-3中，GH18几丁质酶在几丁质去聚合中起主导作用，而SsChi19A提供互补的催化功能。有趣的是，SsChi19A识别和水解CMC的能力表明其具有更广泛的底物适应性，这可能代表了GH19几丁质酶家族中功能多样性一个此前被低估的方面。跨家族……

**CRediT作者贡献声明**

赵莎：撰写——初稿，方法论，形式化分析，数据管理。
温飞越：方法论，形式化分析。
孙晓萌：方法论，形式化分析。
董一宁：资金获取。
邢盛：撰写——审阅与编辑。
王鹭山：撰写——审阅与编辑，资金获取。
丁波：撰写——审阅与编辑。
吴秀云：撰写——审阅与编辑，项目管理，资金获取。

**资金**

本研究由山东省自然科学基金（ZR2024QC184，ZR2025MS470）、微生物技术国家工程实验室前沿与挑战项目（SKLMTFCP-2023-02）、微生物技术国家重点实验室开放基金项目（M2023-14）以及山东大学青年学者未来计划资助。

**利益冲突声明**

作者声明不存在可能影响本文所述工作的已知竞争性经济利益或个人关系。

**致谢**

感谢山东大学微生物技术国家重点实验室生命与环境科学核心设施的朱静、李智峰、屈静尧和任向梅进行CD、LC-MS/MS和HPLC分析。

**词汇表**

CMC：羧甲基纤维素
DNS：3,5-二硝基水杨酸
DA：N-乙酰化程度
DP：聚合度
DS：协同指数
ET：静电相互作用
GH：糖苷水解酶
HPLC：高效液相色谱

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