Sigma因子RpoD在乙醇胁迫条件下调控植物乳杆菌希尔加德氏菌Q19的luxS基因表达及生物膜形成

《Food Bioscience》：Sigma factor RpoD regulates luxS gene expression and biofilm formation in Lentilactobacillus hilgardii Q19 under ethanol stress

　　

摘要

由乳酸菌 (LAB) 启动并完成的苹果酸发酵 (MLF) 是生产高质量陈年葡萄酒的关键步骤。然而，全球变暖导致葡萄含糖量增加，进而使葡萄酒中的乙醇水平升高，这对乳酸菌的生长构成了重大挑战。luxS 基因可以通过调节生物膜形成来保护乳酸菌免受极端环境的影响。初步研究表明，在 17% (v/v) 乙醇胁迫下，Lentilactobacillus hilgardii Q19 中的 luxS 基因会上调，但其调控机制尚不清楚。在本研究中，我们构建了 L. hilgardii Q19 的 luxS 基因过表达和敲除菌株，发现 luxS 基因显著增强了生物膜形成和乙醇耐受性。此外，我们鉴定了结合于 luxS 基因启动子的关键转录因子 RpoD，并通过构建 RpoD 突变菌株确认了其对 luxS 基因表达和生物膜形成的正调控作用。这些发现阐明了 luxS 基因在乙醇胁迫下调控 L. hilgardii Q19 生物膜形成的转录机制，为乳酸菌在高乙醇环境中的适应性反应提供了新的理论和实践见解。

引言

由于全球变暖，宁夏等炎热葡萄酒产区葡萄含糖量更高，导致葡萄酒乙醇含量更高。在葡萄酒发酵期间，高浓度乙醇对乳酸菌造成显著胁迫，导致细胞形态和膜通透性改变，抑制细菌生长，并常导致 MLF 延迟甚至失败 (Chen 等，2020 年；De Orduna, 2010 年)。在葡萄酒发酵过程中，乳酸菌（如 Lactiplantibacillus plantarum 和 Oenococcus oeni）形成生物膜的能力与增强的乙醇耐受性密切相关 (Kubota 等，2008 年；Palud 等，2004 年)。与浮游细胞相比，MLF 期间乙醇胁迫下的生物膜形式乳酸菌表现出更高的存活率 (Bastard 等，2016 年)。由多糖、蛋白质和细胞外 DNA 组成的生物膜基质，可能通过维持细胞完整性而有助于乳酸菌的这种增强存活能力 (Yao 等，2022 年)。

在乳酸菌中，LuxS/AI-2 群体感应系统在调节生物膜形成方面起着重要作用 (Wei 等，2023 年)。luxS 基因编码 S-核糖基同半胱氨酸裂解酶 (LuxS)，这是调节生物膜形成、代谢和毒力的 LuxS/AI-2 群体感应系统的关键组分 (Gu 等，2018 年)。在 Bifidobacterium longum NCC2705 中，luxS 基因过表达增强了生物膜发育 (Sun 等，2014 年)。相反，在 Lactobacillus fermentum 中删除 luxS 基因会降低生物膜基质中与脂肪酸、胞外多糖、蛋白质和 eDNA 相关的基因表达，导致生物膜形成严重受损 (Zhang 等，2022 年)。尽管 luxS 基因已被证实参与几种乳酸菌的生物膜形成，但关于控制其转录的调控机制知之甚少，特别是在乙醇胁迫下。

从宁夏葡萄酒产区贺兰山分离的 L. hilgardii Q19，其乙醇和耐冷性更高，MLF 后挥发性物质的种类和数量多于常用的商业菌株如 Oenococcus oeni，使其成为高乙醇条件下 MLF 的潜在候选菌株 (Wang 等，2023 年)。我们之前的研究表明，在 17% (v/v) 乙醇胁迫下，耐乙醇菌株 L. hilgardii Q19 的 luxS 基因表达量明显高于对乙醇敏感的菌株 L. hilgardii ATCC 8290，表明 luxS 基因可能参与 L. hilgardii Q19 对高乙醇胁迫的适应性反应 (补充表 S1)。因此，由 luxS 基因调控的生物膜形成可被视为增强 L. hilgardii Q19 在乙醇胁迫下存活的重要适应性策略。

转录因子 (TFs) 是结合特定 DNA 序列以响应环境胁迫调节基因转录和蛋白质表达的蛋白质 (Weidemüller 等，2021 年)。例如，GadR 增强 Lactobacillus brevis 的耐酸性 (Gong 等，2019 年)。而 Lactobacillus sakei CRL1862 的转录组分析鉴定了低温条件下与生物膜形成相关的转录因子差异表达 (Moadelighomi 等，2022 年)。然而，L. hilgardii Q19 中 luxS 基因的转录调控仍然未知。

因此，阐明乙醇胁迫下 luxS 基因的转录调控将加深我们对 L. hilgardii Q19 乙醇适应和生物膜形成分子机制的理解。本研究的结果也可能有助于开发具有更高乙醇耐受性的乳酸菌发酵剂，用于高酒度葡萄酒的苹果酸发酵。

章节片段

菌株和培养条件

L. hilgardii Q19 分离自中国宁夏葡萄酒产区。L. hilgardii ATCC 8290 购自内蒙古农业大学。乳酸菌株 (L. hilgardii Q19, L. hilgardii ATCC 8290, L. hilgardii Q19-+luxS/ purR/ argR/ rpoD, L. hilgardii Q19-ΔluxS/ rpoD) 在 30°C 下在 de Man Rogosa Sharpe (MRS) 培养基中培养。Escherichia coli DH5α (E. coli DH5α-+luxS/ purR/ argR/ rpoD) 和 BL21 (E. coli BL21-RpoD) 菌株在 37°C 下在 Luria Bertani (LB) 培养基中振荡培养于

L. hilgardii Q19 生物膜形成与乙醇耐受性的关系

如表 6 所示，在 17% (v/v) 乙醇胁迫下培养三天后，L. hilgardii Q19 表现出显著更高的生物膜形成 (OD_595nm= 0.157 ± 0.01)，与 L. hilgardii ATCC 8290 (OD_595nm= 0.112 ± 0.01) 相比。在相同胁迫条件下，L. hilgardii Q19 的存活率也显著更高。

luxS 基因重组菌株构建

为了研究 luxS 基因在生物膜形成和乙醇耐受性中的作用，构建了 L. hilgardii Q19 的重组菌株，包括过表达 (

讨论

乳酸菌 (LAB) 在食品发酵过程中至关重要。然而，在工业生产过程中，乳酸菌经常暴露于恶劣的环境条件下，如乙醇、温度、pH 极端值和渗透压，所有这些因素都会显著影响其生长和代谢功能²⁷。乙醇是葡萄酒发酵过程中乳酸菌（如 O. oeni、L. plantarum 和 L. hilgardii）面临的主要胁迫因素之一 (Sumby 等，2019 年；Chen 等，2020 年；

结论

在 17% (v/v) 乙醇胁迫下，luxS 基因过表达显著促进了 L. hilgardii Q19 的生物膜形成和存活率，而 luxS 基因删除则损害了这两种性状。转录因子 RpoD 被鉴定为 luxS 基因表达的正调控因子，而 ArgR 和 PurR 则充当负调控因子。结果表明，RpoD 正调控 luxS 基因表达，并与 L. hilgardii Q19 的生物膜形成和乙醇耐受性相关。

总之，

CRediT 作者贡献声明

齐璇：写作 – 审阅与编辑、方法论、调查研究。刘晓文：写作 – 原稿撰写、验证、方法论、调查研究。马文：监督、资源、方法论、概念化。金钢：写作 – 审阅与编辑、监督、资源、资金获取、概念化

未引用参考文献

Aleksandrzak-Piekarczyk 等，2019 年；B?hning 等，2024 年；De Orduna, 2010 年；Flemming 和 Wingender, 2010 年；Hellman 和 Fried, 2007 年；Liu 等，2022 年；Lu 等，2018 年；Maddocks 和 Oyston, 2008 年；O'Toole, 2011 年；Paget 和 Helmann, 2003 年；Palud 等，2024 年；Schauder 等，2001 年；Xiao 等，2017 年；Zhuang 等，2023 年。

利益冲突

作者已声明不存在利益冲突。

资助

本研究得到宁夏回族自治区重点研发计划 (编号：2023BCF01027) 和国家自然科学基金 (编号：32160578) 的资助。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系，这些利益或关系可能被认为会影响本论文中报告的工作。

刘晓文|齐璇|马文|金钢

宁夏大学葡萄酒与园艺学院，中国银川 750021