## 中文标题 大豆常见代谢物与抗氧化活性分析揭示不同种子和子叶颜色间的生化变异及关联基因组区域

《Food Bioscience》：Common metabolite and antioxidant activity analyses of soybeans reveal biochemical variation and associated genomic regions across seed and cotyledon colors

　　

理解大豆种子相关性状的生化变异及其遗传基础对于功能性食品开发和育种计划至关重要。本研究分析了不同种子和子叶颜色大豆中的目标代谢物、总代谢物含量、抗氧化活性及相关基因。变异系数从总不饱和脂肪酸的2.02%到矢车菊素-3-O-糖苷（cyanidin-3-O-glycoside）的146.69%不等，表明存在显著的生化多样性。黑大豆的酚类和花青素含量显著高于棕、绿、黄大豆，抗氧化能力更强，脂肪酸谱更优（p < 0.05），显示出更优越的功能潜力。相比之下，子叶颜色对大多数生化性状的影响有限。主要代谢物，包括6″-O-丙二酰基染料木苷（6″-O-malonylgenistin）、矢车菊素-3-O-葡萄糖苷（cyanidin-3-O-glucoside）和亚油酸（linoleic acid），无论颜色如何，其各自类别中均占主导地位。多变量分析揭示了不同种子颜色间独特的代谢物关联模式。全基因组关联分析（genome-wide association study，GWAS）鉴定了与酚类含量、异黄酮、脂肪酸和抗氧化活性相关的显著基因组区域。在连锁不平衡（linkage disequilibrium，LD）定义区间内，基于标记邻近性、功能注释、生物学相关性及基因本体（Gene Ontology，GO）富集分析，优先筛选出几个推定候选基因，包括Glyma.15G122200、Glyma.11G107600、Glyma.13G154400、Glyma.13G194500、Glyma.19G119100和Glyma.09G207700。这些基因为进一步精细定位、表达分析和功能验证提供了可检验的假说。它们还支持将种皮颜色用作功能性代谢物丰富度的实用指标，并突显了用于进一步验证及未来可能用于大豆品质育种的基因组区域和推定候选基因，以增强营养品质和促进健康的特性。

## 论文解读

大豆（Glycine max (L.) Merrill）是全球最重要的经济豆科作物之一。其种子富含蛋白质、纤维、脂质、矿物质，并含有异黄酮、花青素、皂苷和酚酸等多种生物活性次生代谢物，具有抗氧化、抗炎和心脏保护等健康功效。然而，种子性状如子叶颜色、种皮颜色和种脐颜色对生化成分的影响尚不明确。主要调控位点如I、R、T控制种皮颜色，D1和D2影响子叶颜色，但这些基因与代谢物变异的关系仍不清楚。已有研究多针对有限的代谢物类别或颜色分组，结果不一致。因此，有必要将代谢物谱分析与全基因组关联分析（genome-wide association study，GWAS）相结合，以阐明种子颜色与生化组成的关系，并支持营养品质改良育种。研究人员从韩国国家农业生物多样性中心（National Agrobiodiversity Center，Jeonju，Republic of Korea）获取230份韩国大豆地方品种，在统一环境条件下种植，评估了子叶颜色（黄：193份；绿：37份）和种子颜色（黑：88份；棕：11份；绿：45份；黄：86份）与总酚、总皂苷、异黄酮、花青素、脂肪酸谱及抗氧化活性的关联，并通过GWAS鉴定相关基因组区域和候选基因。该研究发表在《Food Bioscience》。

研究人员采用的关键技术方法包括：基于Folin-Ciocalteu法和香草醛-硫酸法的分光光度法测定总酚含量（total phenolic content，TPC）和总皂苷含量（total saponin content，TSC）；采用超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）定量异黄酮和花青素；采用气相色谱-火焰离子化检测器（GC-FID）分析脂肪酸甲酯（fatty acid methyl esters，FAMEs）；运用DPPH•清除、ABTS•⁺清除和铁离子还原抗氧化能力（ferric reducing antioxidant power，FRAP）三种方法评价抗氧化活性。基因分型采用大豆180K Axiom Soya SNP数组，经质量控制后保留67,222个高质量SNPs。GWAS使用GAPIT软件中的7种模型（GLM、MLM、CMLM、MLMM、SUPER、FarmCPU、BLINK），基于群体LD衰减（平均约373 kb）定义候选区间，并结合标记邻近性、功能注释、生物学相关性和基因本体（GO）富集分析优先筛选推定候选基因。

### 3.1. Variations of biochemical components（生化组分变异）

**3.1.1. Total phenol and total saponin contents（总酚和总皂苷含量）**
全群体中TSC范围为7.36-52.88 mg DE/g（变异系数35.60%），TPC范围为2.33-6.77 mg GAE/g（变异系数16.97%）。统计分析显示，种子颜色显著影响TPC和TSC，其含量顺序为黑大豆最高（TSC 32.95 mg DE/g，TPC 4.80 mg GAE/g），黄大豆最低；子叶颜色无显著效应。这表明显色种皮可作为酚类和皂苷含量的指示性状。

**3.1.2. Identification and quantification of isoflavones（异黄酮的鉴定与定量）**
在所有材料中检测到6种目标异黄酮，变异系数从6″-O-丙二酰基大豆黄苷的7.10%到大豆黄苷的56.58%。6″-O-丙二酰基染料木苷（6″-O-malonylgenistin）是最丰富的异黄酮，其次为6″-O-丙二酰基大豆黄苷。子叶和种子颜色仅对6″-O-malonylgenistin有显著影响，其在绿子叶（1.69 mg/g）和黑种皮（1.66 mg/g）大豆中含量较高。研究表明，种皮颜色不能可靠预测异黄酮含量。

**3.1.3. Identification and quantification of anthocyanins（花青素的鉴定与定量）**
花青素分析使用种皮样品，飞燕草素-3-O-葡萄糖苷（delphinidin-3-O-glucoside，D-3-O-G）、矢车菊素-3-O-葡萄糖苷（cyanidin-3-O-glucoside，C-3-O-G）和矮牵牛素-3-O-葡萄糖苷（petunidin-3-O-glucoside，Pt-3-O-G）的变异系数均超过100%。种子颜色对所有花青素均有显著影响，含量顺序为黑>棕>绿>黄；黑大豆中C-3-O-G平均达9.30 mg/g，比其他颜色高13倍以上。结果显示黑大豆是花青素的丰富来源。

**3.1.4. Identification and quantification of fatty acids（脂肪酸的鉴定与定量）**
所有材料中均检出5种脂肪酸，变异系数在5.09%（亚油酸）至33.95%（硬脂酸）之间。种子颜色显著影响所有脂肪酸，而子叶颜色仅显著影响棕榈酸。黑大豆具有最高的亚油酸（61.07%）、亚麻酸（7.93%）、总不饱和脂肪酸（total unsaturated fatty acids，TUFA）（84.07%）、多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFA）（69.00%）、TUFA/总饱和脂肪酸（TUFA:TSFA）比值（5.35）和双键指数（double bond index，DBI）（161.00）。这表明黑大豆的脂肪酸组成更有利。

**3.1.5. Antioxidant activities（抗氧化活性）**
DPPH•清除活性（0.43-1.82 mg AAE/g）、ABTS•⁺清除活性（5.05-13.47 mg TE/g）和FRAP（0.90-7.71 mg AAE/g）均表现出超过20%的变异系数。种子颜色显著影响所有抗氧化活性，黑大豆的三种活性均最高，黄大豆最低；子叶颜色无显著效应。黑大豆的强抗氧化能力可能与其高酚类、皂苷和花青素含量有关。

### 3.2. Multivariate analysis（多变量分析）
双向层次聚类将230份材料分为9个簇，其中以黑种皮为主的簇VII和簇IX含有最高的花青素、总酚和抗氧化活性。主成分分析中，前两个主成分共解释53.2%的变异，黑种子大豆在PC1正侧聚集。相关分析显示，总酚和花青素与抗氧化活性显著正相关，不同种子颜色组的代谢物关联模式存在差异。

### 3.3. GWAS results and candidate gene prioritization（GWAS结果与候选基因优先排序）

**3.3.1. General（概述）**
通过7种GWAS模型，共鉴定出66个独特的标记-性状关联，其中37个SNPs满足显著性和解释≥5%表型变异的标准。基于LD区间和多种证据，优先筛选出多个推定候选基因。

**3.3.2. Total phenol content（总酚含量）**
与总酚相关的显著标记AX-90482355位于15号染色体，优先候选基因Glyma.15G122200编码重金属转运/解毒超家族蛋白，其功能涉及金属离子结合和细胞氧化还原稳态，为总酚积累提供了生物学解释。

**3.3.3. Isoflavone (6″-O-malonylglycitin)（异黄酮：6″-O-丙二酰基大豆黄苷）**
4个SNPs与6″-O-丙二酰基大豆黄苷相关。优先候选基因Glyma.11G107600（1,4-α-葡聚糖分支酶样蛋白）和Glyma.04G017700（糖苷水解酶样蛋白）的注释功能与糖基化修饰相关，为异黄酮糖基化变异提供潜在机制。

**3.3.4. Fatty acids（脂肪酸）**
多个候选基因与脂肪酸相关。Glyma.13G154400（F-box家族蛋白）可能通过泛素化途径调节脂质代谢酶；Glyma.16G140300（Sec14p样磷脂酰肌醇转移蛋白）参与膜脂组成和信号传导；Glyma.20G187600同时关联亚油酸和油酸，提示不饱和脂肪酸生物合成的共同调控。

**3.3.5. Antioxidant activities（抗氧化活性）**
共14个SNPs与抗氧化活性相关。ABTS•⁺清除活性相关候选基因包括Glyma.19G119100（糖基转移酶）、Glyma.19G110100/121000（氧化还原酶）和Glyma.20G148000（细胞色素P450）；DPPH•清除活性相关候选基因为Glyma.09G207700（NAD(P)结合蛋白）；FRAP相关候选基因为Glyma.08G181200（磷脂酰丝氨酸脱羧酶）。这些基因的注释功能涉及氧化还原平衡、次生代谢物修饰等。

### 讨论与结论

讨论部分指出，种子颜色对多数生化性状的影响强于子叶颜色，黑大豆在酚类、皂苷、花青素及抗氧化活性方面显著优于其他颜色，支持其作为功能性食品开发候选材料。同时，研究也承认颜色分组样本量不均（棕色种皮及绿色子叶组较少）可能影响统计效力，未来需要更大且更平衡的群体及多环境试验来验证关联的稳定性。

**结论**：本研究揭示了不同子叶和种子颜色大豆中关键生化性状的广泛变异。与子叶颜色不同，种子颜色显著影响多种代谢物和抗氧化活性。黑大豆具有更高水平的皂苷、酚类和花青素，以及更强的抗氧化活性和更有利的脂肪酸谱。全基因组关联分析鉴定了与酚类化合物、脂肪酸和抗氧化相关性状的显著标记-性状关联。在LD定义的基因组区间内，整合标记邻近性、功能注释、生物学相关性及GO富集结果，优先筛选了生物学上合理的候选基因。这些推定候选基因的注释功能涉及离子稳态、糖基化、脂质代谢、氧化还原调控和次生代谢物修饰，为大豆种质生化变异的机制提供了线索。该研究证实了黑大豆的生化优越性，通过整合GWAS鉴定了相关基因组区域，为未来验证和标记辅助育种提供了宝贵资源。总之，这些发现增进了对大豆营养品质遗传架构的理解，并为未来功能验证和基因组辅助育种奠定了基础。