转运蛋白调控西奥迪克阿斯pergillus（Aspergillus westerdijkiae）对弱酸环境的适应能力、赭曲毒素A（ochratoxin A）的生物合成过程以及对该真菌的宿主定植行为

《Food Research International》：Transporters govern weak acid adaptation, ochratoxin a biosynthesis, and host colonization in aspergillus westerdijkiae

　　

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  AwPat1、AwAap1 和 AwMfs1 调控 A. westerdijkiae 对弱酸的适应能力。
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  AwPat1 和 AwAap1 还调节形态发生和应激适应。
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  转运蛋白的缺失使真菌对食品基质中的防腐剂更敏感。
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  转运蛋白的缺失显著影响赭曲霉毒素 A (OTA) 的生物合成。
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  这些蛋白质是控制腐败的有效靶点，而不会引发抗性。

引言

真菌腐败和霉菌毒素污染每年造成的全球损失超过 100 亿美元（Fisher 等，2012）。这一问题因环境毒性和传统杀菌剂效力下降（由于真菌抗性）而变得更加严重（Fisher 等，2018；Martinez，2009）。在这些霉菌毒素威胁中，赭曲霉毒素 A (OTA) 作为 2B 类人类致癌物，由于其肾毒性，仍然是咖啡和谷物等商品中的主要危害（Ochratoxin，1993）。虽然历史上将其归因于 Aspergillus ochraceus，但分子系统发育研究已经明确了 OTA 污染的来源。对钙调蛋白和 β-微管蛋白位点的分析揭示了一个隐匿的物种复合体，证明 Aspergillus westerdijkiae 是 Circumdati 组中的主要 OTA 产生菌（Chen 等，2017；Frisvad 等，2004；Wang 等，2022）。这一分类修正确定了 A. westerdijkiae 作为控制食品安全霉菌毒素威胁的主要目标。因此，精确地针对 A. westerdijkiae 对控制 OTA 污染和开发新的食品安全策略至关重要（Wang 等，2023）。

A. westerdijkiae 能够耐受广泛的环境条件，并定殖于多种基质上，其对抗弱酸的强耐受性使其成为研究真菌酸耐性的宝贵对象（Yi 等，2026）。在富含碳水化合物的商品（如咖啡和谷物）中，OTA 的最大产生发生在约 30°C 和 0.95–0.97 a_w 的条件下，然而该真菌在海上运输期间的非最佳条件下仍能存活（Akbar 等，2020；Medina 等，2015）。基因组分析鉴定出超过 50 个次级代谢产物生物合成基因簇，表明其具有利用多种碳源的广泛能力（Frisvad 等，2019；Han 等，2016）。其中，一个保守的基因簇控制着弱酸耐性，并影响 OTA 的产生和致病性（Yi 等，2026）。这种病原体还能侵入蛋白质含量高、盐分高的环境。在干腌肉类中，耐盐的 A. westerdijkiae 在约 25°C 和 0.93 a_w 条件下能够胜过起始菌株 Penicillium nalgiovense，并穿透包装材料污染内部组织（Iacumin 等，2009；Merla 等，2018）。

几个世纪以来，人们一直使用传统的食品保存方法，包括腌制、干燥、发酵和熏制（Joardder & Masud，2019）。现代工业实践结合了热处理、非热处理和化学技术（Fellows，2022）。为了控制真菌腐败，化学防腐剂仍然是标准手段。苯甲酸、丙酸和山梨酸等弱酸因其对抗霉菌和酵母的有效性而被广泛使用。这些化合物在低 pH 值的食品基质中特别活跃，包括酸性和烘焙食品（Nasrollahzadeh 等，2022）。

在食品保存中广泛使用弱有机酸（WOAs），如苯甲酸，会选择出耐酸的真菌。WOAs 的抗菌活性取决于质子化后的亲脂酸（HA）在低 pH 环境中穿过质膜的过程。进入细胞后，内部分解释放出质子和反离子，导致细胞质酸化、阴离子积累以及营养物运输和生物能量所需质子驱动力的崩溃（Brul & Coote，1999）。这种酸化会损害线粒体功能和酶活性，特别是苯甲酸的影响更为显著（Hazan 等，2004）。然而，如 Zygosaccharomyces bailii 这样的腐败微生物通过上调外排转运蛋白和改变其转录谱来适应这些防腐剂（Stratford 等，2013）。在产毒真菌中，这种化学压力还能诱导次级代谢和霉菌毒素的生物合成（Keller，2019）。因此，了解弱酸耐性的遗传基础对于开发对抗真菌抗性的保存策略至关重要（Brul & Coote，1999）。

在 A. niger 中，转录因子 WarA 对抗弱有机酸的耐受性是必需的；ΔwarA 突变体对丙酸、丁酸、缬氨酸、己酸、山梨酸和苯甲酸高度敏感（Geoghegan 等，2020）。真菌的 pH 平衡通常依赖于 V-ATPase 和质膜 H⁺-ATPase Pma1p，如在酵母中发现的那样（Martínez-Mu?oz & Kane，2008）。然而，相关物种 A. westerdijkiae 对传统弱酸防腐剂的耐受性更广（Mikkola 等，2015）。这种表型是由有机酸脱羧酶基因簇（例如 cdcA、sdrA）和 WarA 调控的（Geoghegan 等，2020；Lubbers 等，2019）。

真菌对环境压力的适应依赖于膜转运系统（Diallinas & Scazzocchio，无日期）。主要促进剂超家族（MFS）和氨基酸-多胺-有机阳离子（APC）超家族代表了最大的两个转运蛋白类别（Bianchi 等，2019a；Marger & Saier Jr，1993）。MFS 蛋白在 Alternaria alternata 和 Candida 物种中调节多重药物耐受性和毒素外排（Arendrup & Patterson，2017；Banerjee 等，2022）。APC 超家族调节氨基酸和多胺的平衡，但功能研究主要限于模型生物，如 Saccharomyces cerevisiae 和 A. nidulans（Bianchi 等，2019b；Cameron 等，2019）。

苯甲酸和丙酸等弱有机酸是食品保存中的标准抗真菌剂。由于这些酸主要通过细胞内酸化和阴离子积累引起毒性，因此认为膜转运蛋白通过阴离子外排或 pH 缓冲来促进生存（Guan & Liu，2020a；van Beilen 等，2014）。尽管之前的研究已经确定了全局调节因子（例如 WarA）和 ATP 依赖的 ABC 转运蛋白在有机酸耐受性中的作用（Geoghegan 等，2020；Yi 等，2026），但在 A. westerdijkiae 中介弱酸耐受性的具体 MFS 和 APC 转运蛋白仍很大程度上尚未明确。这些转运蛋白是否将应激适应与霉菌毒素（OTA）的生物合成联系起来也尚不清楚（Atasoy 等，2024）。在这里，对野生型（WT）菌株在苯甲酸存在和缺失条件下的比较转录组学分析确定了三个候选的弱酸适应转运基因。对这些缺失突变体的鉴定表明，这些转运蛋白不仅调节酸耐性，还差异性调节 OTA 的生物合成和宿主定殖以及基础真菌发育。

部分片段

菌株和生长条件

本研究中使用的所有真菌菌株均列于表 1 中。A. westerdijkiae ΔKu70 被用作 WT 菌株，因为它具有较高的同源重组效率（Krappmann 等，2006；Wang 等，2022）。所有菌株保存在含有 33%（v/v）甘油和葡萄糖肉汤（PDB）的冷冻管中，温度为 -80°C。菌株接种在葡萄糖琼脂（PDA）平板上，并在 28°C 下培养 7 天以激活。通过添加 0.05%（v/v）的 Tween 80 来收集孢子。

A. westerdijkiae 对酸应激的转录组反应

我们对在 2 mM 苯甲酸和正常条件下培养的 A. westerdijkiae WT 菌株进行了转录组测序，以识别降低防腐剂效果的机制。我们发现了 1745 个差异表达基因（864 个上调和 881 个下调）（图 1a）。功能注释显示，122 个基因与转运相关，反映了苯甲酸压力下的膜转运动力学变化（图 1b）。其他改变的途径包括氨基酸

讨论

弱酸（如苯甲酸和丙酸）的抗菌效果取决于它们的未解离状态，这使它们能够穿过真菌质膜并在接近中性的细胞质中解离（Guan & Liu，2020b）。这种解离释放出质子（H⁺）和相应的阴离子，降低细胞内 pH 值并破坏跨膜质子驱动力（PMF）（Ullah 等，2012）。转录组数据表明，这种物理化学应力会重新编程

结论

这些结果表明，特定的转运系统对于真菌在弱酸防腐剂条件下的生长和致病性至关重要。我们的研究揭示了苯甲酸处理会导致真菌发生显著的转录变化，从而鉴定出与转运相关的蛋白质 AwPat1、AwAap1 和 AwMfs1，它们影响真菌的生长、发育、OTA 的产生和病原过程。虽然我们已经提出了关于这些功能的初步假设

CRediT 作者贡献声明

Mumin Zheng： 撰写——原始草稿，方法论，概念化。Yufan Yang： 调查。Erfeng Li： 方法论，概念化。Jiaqian Zhang： 资源，方法论。Fuguo Xing： 监督，项目管理。Gang Wang： 撰写——审稿与编辑，监督，项目管理。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

本工作得到了中国国家重点研发计划（编号 2024YFD1601000）和山东省自然科学基金（编号 ZR2025MS489）的支持。

>Mumin Zheng|Yufan Yang|Erfeng Li|Jiaqian Zhang|Fuguo Xing|Gang Wang