通过由地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）介导的强化发酵过程提升福砖茶的化学成分和香气特征：来自靶向化学分析、挥发性化合物组学及宏基因组学的研究证据

《Food Research International》：Enhancing chemical and aroma profiles of Fu brick tea via Bacillus licheniformis–mediated enhanced fermentation: evidence from targeted chemistry, volatilomics, and metagenomics

　　•地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）被用作茯砖茶发酵中的功能性菌株。•观察到地衣芽孢杆菌与结晶脉孢霉（Aspergillus cristatus）之间的代谢协同作用。•增强的发酵过程促进了多酚和儿茶素的转化，降低了苦味。•与花香、果香和木质香相关的挥发性化合物显著增加。

**引言**
茯砖茶是一种传统的中国后发酵茶，主要产于湖南省和陕西省（Li等人，2024年）。近年来，由于其独特的化学成分和相关的生物活性，茯砖茶受到了越来越多的关注。茯砖茶富含生物活性成分，包括多酚、氨基酸和生物碱，这些成分赋予了它独特的感官特性。越来越多的证据表明，这些化合物与调节肥胖、高脂血症和高血糖相关的代谢参数有关，并具有抗氧化活性和潜在的抗癌效果（Liu等人，2019年；Tan等人，2024年）。茯砖茶的特性是“开花”过程，在此过程中，通过控制温度和湿度来塑造独特的微生物生态。在这些条件下，结晶脉孢霉优先生长并成为主导真菌物种，导致茶基质上形成大量的金黄色颗粒，通常被称为“金花”（Chen等人，2021年）。结晶脉孢霉在“开花”阶段的优势与其对茶成分的广泛生化转化密切相关，并在茯砖茶风味特性的形成和功能性化合物的发展中起着关键作用（Du等人，2022年；Zhu等人，2020年）。先前的研究表明，结晶脉孢霉在多酚化合物的转化中起着关键作用，并参与特征性风味化合物的形成，从而为茯砖茶独特的感官特性做出了贡献（Chen等人，2023年）。进一步的证据表明，茯砖茶的特征性挥发性化合物主要归因于结晶脉孢霉在发酵过程中分泌的胞外酶（Wang等人，2024年）。基于对传统真菌开花机制的深入了解，通过调控发酵过程来进一步提高茯砖茶的质量已成为一个新兴的研究方向。

**微生物辅助的强化发酵**
近年来，微生物辅助的强化发酵逐渐成为发酵领域的研究热点，为改善传统发酵食品的风味特性和化学成分提供了一种可控策略（Fang等人，2023年）。通过目标接种优势微生物，可以进一步增强感官特性和化学组成，显示出在发酵食品生产中的巨大应用潜力（Gao等人，2025年）。例如，在四川泡菜的发酵过程中，共接种魏氏变酸菌（Weissella cibaria）和植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）已被证明可以加速发酵过程，增强挥发性香气化合物的形成，并提高整体感官质量，同时降低亚硝酸盐和生物胺的水平，从而比单菌株发酵具有更好的效果（Xiang等人，2020年）。同样，酵母辅助的酱油发酵也被报道可以协同调节氨基酸组成并进一步促进香气化合物的形成，从而提高最终产品的整体风味质量（Cui等人，2014年）。此外，先前的研究还表明，通过接种金色青霉菌（Penicillium chrysogenum）可以改变普洱茶的化学质量并改善其感官特性（Liu等人，2021年）。尽管强化发酵在其他发酵食品系统中展现了巨大的应用潜力，但在以真菌为主导的茯砖茶发酵系统中的应用尚未得到系统研究。特别是，关于强化发酵过程中微生物群落演替、化学成分重塑和香气谱变化的全面见解仍然不足。

**地衣芽孢杆菌的作用**
地衣芽孢杆菌是一种多功能细菌，能够分泌多种水解酶，包括淀粉酶、蛋白酶、木聚糖酶、葡聚糖酶和纤维素酶，从而促进大分子的降解和风味前体的生成（Liu等人，2024年；Qian等人，2023年）。由于这些代谢能力，地衣芽孢杆菌在 Pixian 黄豆酱和白酒等传统发酵食品的生产中被广泛报道具有积极作用，有助于风味的发展和发酵性能的提高（Yuan等人，2026年；Zhu等人，2025年）。特别是，地衣芽孢杆菌与其他微生物之间的协同作用已被证明可以通过增强的糖化和酯化作用促进强烈风味白酒中的酯类形成，以及关键前体代谢物的积累，从而形成特征性风味化合物（Chen等人，2026年）。值得注意的是，我们之前的研究表明，在茯砖茶发酵过程中，地衣芽孢杆菌的相对丰度显著增加，这表明该属可能在品质形成中起重要作用（Huang等人，2024年）。进一步的证据表明，地衣芽孢杆菌也可能参与茯砖茶中芳香化合物的形成（Li等人，2024年）。总的来说，这些发现指出，在传统的结晶脉孢霉主导的发酵系统中引入地衣芽孢杆菌可能通过协同的酶促作用和代谢调节进一步增强茯砖茶的风味特性和化学质量。

**研究目的**
本研究旨在系统评估地衣芽孢杆菌介导的强化发酵对茯砖茶主要化学成分、挥发性香气谱和微生物群落动态的影响。首先从茯砖茶样品中分离出一种地衣芽孢杆菌菌株，并根据其形态和生化特征进行鉴定。通过逐步实验框架，从评估地衣芽孢杆菌的独立效果到其与结晶脉孢霉的相互作用，最终在茯砖茶中进行验证。在散装黑茶系统中，进行单菌培养发酵以阐明地衣芽孢杆菌对风味特性和功能性化合物的独立影响。在金花散装茶系统中，与结晶脉孢霉共发酵以研究微生物相互作用及其在香气形成和化学重塑中的作用。此外，在固态茯砖茶发酵系统中，将地衣芽孢杆菌增强发酵与传统的自然真菌开花过程进行比较，以评估其在砖茶加工中的实际应用性。通过结合目标化学分析、基于GC–MS的挥发组学和宏基因组测序，本研究旨在阐明地衣芽孢杆菌介导的强化发酵如何调节微生物演替和风味相关化学成分的形成，从而为茯砖茶的质量提升和工业应用提供理论基础。

**方法**
**微生物分离与鉴定**
茯砖茶样品来自中国湖南省益阳茶厂有限公司。从多个茯砖茶样品中分离出细菌菌株。简要来说，将茶叶样品悬浮在无菌生理盐水中，并用无菌玻璃珠剧烈振摇以促进微生物从茶砖基质中释放。所得悬浮液在80°C下热处理后，在冰浴中迅速冷却，以灭活营养细胞。

**地衣芽孢杆菌的鉴定和生长特性**
通过稀释涂布和划线分离得到地衣芽孢杆菌菌株，并在LB琼脂上连续传代三次进行纯化。纯化的菌株在BPM和LB琼脂上显示出可重复的扩展生长（图1A）。革兰氏染色显示其为紫色杆状细胞，证实其革兰氏阳性特征（图1B）。为了进一步明确该菌株的分类学位置，扩增并测序了rpoB、recF和adk基因。

**讨论**
茯砖茶作为一种典型的后发酵茶，在“金花”发酵过程中依赖微生物驱动的酶促反应和底物转化来形成品质（Li等人，2024年）。随着茶叶产业对品质一致性和功能性成分的重视日益增加，在发酵过程中应用功能性微生物已成为提高茶叶风味和健康相关特性的重要策略（Du等人，2022年）。

**结论**
总之，本研究系统评估了外源接种地衣芽孢杆菌在三种发酵底物（包括原始黑茶、金花散装茶和茯砖茶）中的效果。微生物群落谱、相关性分析以及KEGG和CAZy功能注释表明，地衣芽孢杆菌在茯砖茶发酵过程中持续存在，而结晶脉孢霉仍占主导地位，揭示了与潜在代谢变化一致的功能变化。

**作者贡献声明**
赵一桥：撰写–原始草稿，研究，数据管理。肖瑞斌：研究，数据管理。卢圆源：研究，数据管理。王志康：研究。黄建军：方法学，数据管理。王坤博：撰写–审稿与编辑，监督，项目管理。刘中华：监督，概念化。朱明珠：撰写–审稿与编辑，项目管理，概念化。

**伦理声明**
本研究遵循赫尔辛基宣言进行，并获得了湖南农业大学伦理审查委员会的批准（TSF-716-2024）。所有参与者均收到了关于研究的书面信息，并签署了知情同意书。

**知情同意和患者信息**
已从所有参与者或其法定代表处获得参与研究的书面知情同意以及发表文章的同意。保障了参与者的隐私权。

**人类研究**
本研究符合研究进行地的相关法律、监管框架和指南。本研究遵循赫尔辛基宣言进行，并获得了湖南农业大学伦理审查委员会的批准。

**资助**
本研究得到了中国自然科学基金（32472797, 32172217）、湖南省青年科学基金（2025JJ20022）、国家重点研发计划（2022YFD2101103）、湖南省重点研发计划（2024JK2150）、湖南省“三杰”创新人才计划（2022RC1142）以及湖南农业大学校级科研项目（25KJ025）的支持。

**利益冲突声明**
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。