粘质沙雷氏菌香茅醛还原酶的表征：结构导向的工程改造及用于 (S)-香茅醇合成的高效全细胞级联构建

《International Journal of Biological Macromolecules》：Characterization of a neral reductase from Serratia marcescens: Structure-guided engineering and construction of an efficient whole-cell cascade for ( S)-citronellol synthesis

　　

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  一种先前未被表征的香茅醛还原酶生成了对映体过量值（ee）> 99%的（S）-香叶醛。
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  SmNR对香茅醛和NADPH表现出显著的底物偏好性。
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  基于结构的蛋白质工程产生了活性增强的S272D突变体。
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  三酶全细胞级联反应以87.7%的产率生成了（S）-香叶醇。

引言

香叶醇是一种重要的香料分子[1]，存在两种对映异构体形式：（S）和（R）。其中，（S）-香叶醇具有纯正的玫瑰香气，常见于玫瑰、香茅草等植物的精油中；而（R）-香叶醇则具有独特的草本和水果香气，两种异构体的芳香特征存在显著差异。手性分子的（S）和（R）对映体在香气特征、强度和类型上往往表现出显著的不同，这是手性香料化合物中常见的现象。（S）-香叶醇是一种典型的无环单萜醇，具有玫瑰与天竺葵混合的独特香气，同时还具有有效的天然驱虫特性。它在食品、化妆品和农业领域展现出广泛的应用价值[2]、[3]。在食品工业中，该化合物常用于调配柑橘和玫瑰风味的饮料和糖果，有效增强天然香气并优化风味表现。在化妆品配方中，由于其低刺激性和持久的留香特性，它常被用作高档香水和护肤品中的关键香料成分。在农业领域，（S）-香叶醇对白粉虱等害虫的驱避率超过80%，且其可生物降解的特性使其成为开发绿色安全驱蚊产品的理想候选者[4]。药理学研究表明，（S）-香叶醇的镇痛和抗痛觉过敏作用通过阿片受体通路介导，同时它还能调控炎症相关信号通路并显著抑制肥大细胞活化，使其成为具有前景的天然药物单体[5]。

在植物中，（S）-香叶醇的生物合成始于香茅醇，香茅醇通过萜类途径氧化生成橙花醛或香茅醛。香芹醛是橙花醛（反式）和香茅醛（顺式）的混合物，二者互为几何异构体。随后，香茅醛还原酶负责催化香茅醛共轭双键的手性不对称还原，立体选择性地生成具有（S）构型手性碳的（S）-香叶醛。醇脱氢酶（ADH）仅催化醛羰基的加氢还原，不参与手性中心的修饰或翻转，最终产出手构型稳定的（S）-香叶醇[6]。此外，天然存在的老黄色酶（OYE）已被发现能够高效还原香茅醛，所得的香叶醛随后被ADH还原为香叶醇。OYE表现出高度的底物特异性：香茅醛分子中的醛基作为强吸电子基团，能够通过与酶活性位点残基形成氢键实现定向锚定，从而确保其α,β-不饱和CC双键精确位于还原性FMNH?与催化酪氨酸之间。在NAD（P）H提供的电子驱动下，两者协同完成对CC双键的反式加成，高效生成香叶醛。老黄色酶是一类以黄素单核苷酸（FMN）为辅基、以NAD（P）H为电子供体的烯还原酶，在α,β-不饱和醛（如香茅醛）的CC键还原方面表现出优异的催化性能，已成为香叶醇生物合成途径中的关键催化剂[4]、[7]。值得注意的是，属于OYE家族的玫瑰（Rosa hybrida）12-氧代植二烯酸还原酶RhOPR1/2可在体外和植物体内催化香芹醛还原为香叶醛，作为植物次生代谢酶功能多样性的典型案例[3]。在天然存在的微生物来源OYE中，细菌烯还原酶在香茅醛或橙花醛的不对称还原中表现出优异的手性控制能力。例如，Gluconobacter oxydens（氧化葡糖杆菌）的烯还原酶对香芹醛的顺式异构体香茅醛表现出还原偏好性，优先催化香茅醛的还原；在香茅醛被大量消耗后，反式橙花醛也可被该酶不对称还原，两种底物均特异性地生成ee > 99%的（S）-香叶醛[8]。Zymomonas mobilis（运动梭菌）的NCR-EnR可高效催化香芹醛的不对称还原，生成ee > 95%的（S）-香叶醛[8]。Yersinia bercovieri的YersER在辅因子再生体系下催化香芹醛还原为（S）-香叶醛（ee > 99%）[9]。因此，从微生物资源中挖掘和工程化高活性、高对映纯度的OYE，对于实现（S）-香叶醇的绿色高效生物制造具有重要意义。

在过去几年中，香叶醇的生物制造取得了显著进展。系统代谢工程策略，包括模块化途径优化和限速步骤强化，已被用于提高Saccharomyces cerevisiae（酿酒酵母）中香叶醇的产量[2]。此外，玫瑰中β-香叶醇的生物合成途径也得到了全面表征[3]。烯还原酶也越来越多地被用作从α,β-不饱和前体不对称合成香叶醛和香叶醇的生物催化剂[10]。这些进展凸显了开发高效可持续的（S）-香叶醇生产途径的研究兴趣日益增长。

本研究从Serratia marcescens HBQA7中鉴定出一种先前未被表征的烯还原酶SmNR，该酶在催化香茅醛不对称还原生成（S）-香叶醛方面表现出高度的对映选择性。以该烯还原酶为核心模板，通过定点突变修饰关键氨基酸残基以优化催化活性。此外，通过偶联醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶构建了三酶级联途径，实现了从香茅醛到（S）-香叶醇的一步全细胞转化。

章节摘要

菌株、质粒和培养条件

本研究所使用的菌株和质粒如下。Serratia marcescens HBQA7[11]此前已在我们的实验室中筛选并保存，用于克隆烯还原酶基因（粘质沙雷氏菌香茅醛还原酶，SmNR）。Escherichia coli JM109用于基因克隆和质粒构建，而E. coli BL21(DE3)则用于异源蛋白表达和全细胞催化实验。所使用的表达载体为pRSFDuet-1（Kan^R）和pETDuet-1（Amp^R）

香茅醛还原酶的发现与表征

本实验室此前筛选获得了一株对萜类生物合成途径具有耐受性的Serratia marcescens HBQA7菌株[11]，并鉴定出其基因组中编码的一种潜在香茅醛还原酶（一种命名为SmNR的烯还原酶）。进一步的体外酶活性检测表明，SmNR催化香茅醛的不对称还原。为系统研究其催化特性，本研究对重组SmNR进行了异源表达和纯化（图1），

结论

本研究从Serratia marcescens HBQA7中鉴定并表征了一种属于老黄色酶（OYE）家族的先前未被表征的香茅醛还原酶（SmNR）。SmNR对辅酶NADPH和底物香茅醛表现出显著的偏好性，并通过对映选择性催化香茅醛还原为（S）-香叶醛，为（S）-香叶醛及其衍生手性化合物的生物合成提供了新的酶学资源。通过结构

CRediT作者贡献声明

谢瑞诗：撰写——初稿、可视化、调查、概念化。王龙：撰写——审阅与编辑、调查。吴胜芳：方法论。周修文：方法论。杨天：方法论。聂瑶：监督。蔡雨婕：撰写——审阅与编辑、资源、概念化。

利益冲突声明

作者声明不存在任何已知的可能影响本文所报道工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

本研究未获得公共、商业或非营利领域资助机构的专项资助。

Ruishi Xie|Long Wang|Shengfang Wu|Xiuwen Zhou|Tian Yang|Yao Nie|Yujie Cai