大气辉光放电等离子体对苹果汁中鲁氏接合酵母营养细胞的灭活效果及其对果汁质量的影响

《International Journal of Food Microbiology》：Inactivation efficacy of atmospheric glow discharge plasma against Zygosaccharomyces rouxii vegetative cells in apple juice and its impact on juice quality

　　

芽殖酵母（Zygosaccharomyces rouxii）在浓缩果汁和复原苹果汁的腐败过程中占主导地位。其渗透耐受性和生物膜形成能力阻碍了传统果汁灭菌工艺的实施。本研究探讨了大气辉光放电等离子体（GDP）对从商业浓缩汁制备的复原苹果汁中Z. rouxii营养细胞的灭活效果及相应的果汁品质变化。实验研究了不同放电功率、处理时间和工作气体类型的影响。通过活性氧和活性氮物种以及细胞损伤水平探讨了灭活机制。处理前后评估了包括理化性质和营养含量在内的果汁品质指标。两株野生菌株对GDP的耐受性均优于培养物保藏参考菌株。采用350 W空气GDP处理50秒，可完全消除约7.2 log??CFU/mL的三菌株鸡尾酒混合物。空气GDP产生的抑菌臭氧和亚硝酸盐均多于氮气GDP。GDP产生的活性物种与细胞膜脂质过氧化、结构破坏和胞质渗漏相关，这很可能是Z. rouxii灭活的主要驱动因素。GDP处理保留了果汁的营养成分和风味，pH、酸度和颜色的轻微变化均在商业标准范围内。本研究为等离子体技术在果汁工业除菌中的应用提供了支持。主要局限包括仅进行了实验室规模测试、仅检测营养细胞以及菌株覆盖范围较窄。要实现全面的工业化转化，还需进行进一步的中试试验和芽孢子测试。

**引言**

中国是全球最大的浓缩苹果汁出口国，这是该国果蔬加工产业的核心支柱产品。2024年，中国苹果汁出口量达到536,100吨，在全球浓缩苹果汁贸易体系中保持了主导地位（Kracinski等人，2025）。商业浓缩苹果汁（65.0–72.0°Brix）不仅作为大宗贸易商品流通，还是复原单浓度苹果汁的主要原料。这种复原产品是全球消费量最大的果汁，标准总可溶性固形物（TSS）含量约为14°Brix（Rydzak等人，2020）。浓缩果汁和复原苹果汁的pH值范围较低（3.0至4.2）且TSS含量较高。这些固有特性决定了其腐败菌群以耐酸和耐渗透微生物为主（Dhar等人，2022）。在这些腐败微生物中，芽殖酵母（Zygosaccharomyces rouxii）被公认为是导致浓缩和复原苹果汁产品货架期劣化的主要腐败酵母（Wang和Sun，2020）。该酵母具有很强的环境耐受性，可在TSS含量超过70°Brix且pH低至1.8至2.2的极端条件下存活（Dakal等人，2014）。此外，该酵母极易在果汁加工设备的内表面形成致密生物膜，对果汁加工行业广泛使用的常规原位清洗（CIP）工艺具有高度抗性（Zara等人，2020）。因此，通过标准卫生生产操作很难完全去除该酵母。当被污染的浓缩苹果汁作为复原果汁生产的原料时，残留的Z. rouxii会快速增殖，导致产品浑浊、包装膨胀和风味劣化等严重质量问题，给果汁制造商造成巨大经济损失（Escott等人，2018）。Z. rouxii引起的类似腐败事件在其他高糖食品基质中也有广泛报道，反映了该腐败酵母在食品行业中的普遍性（Berti等人，2025；Huang等人，2024）。

目前，热灭菌仍是商业苹果汁加工的主流技术。应用最广泛的两种工艺是巴氏杀菌（85–90 °C，15–30 s）和超高温（UHT，121–135 °C，3–5 s）灭菌（Nehmé等人，2024）。虽然可以实现有效的微生物灭活，但高温暴露会导致维生素C和多酚等热敏性营养素的显著降解，以及最终产品中不良的非酶褐变（Nehmé等人，2024）。近年来，为克服这些缺点，人们广泛探索了多种非热灭菌技术，包括超高压（HPP，又称超高压处理）、脉冲电场（PEF）和超声波处理。然而，固有的局限性限制了其大规模工业应用。HPP受限于高昂的设备投资和运营成本。对于PEF技术，电极侵蚀和高能耗等问题对连续加工构成了挑战（Swayne等人，2024）。类似地，单独使用超声处理往往微生物灭活效果不足，通常需要与其他技术组合使用才能满足工业无菌标准（Beitia等人，2023）。非热等离子体（NTP）作为一种有前景的绿色加工技术脱颖而出，已成为食品灭菌和保鲜的研究热点。NTP为食品加工提供了独特优势，包括室温下的高灭菌效率、对营养和感官品质的最小影响、适中的成本以及对连续生产的适应性（Xu和Bassi，2025）。NTP通过在气体中施加电场产生，生成多种活性物种，包括活性氧物种（ROS）、活性氮物种（RNS）、带电粒子和紫外线光子。这些活性物质可迅速破坏微生物细胞的完整性和代谢功能，产生广谱高效的杀菌作用。在各种NTP构型中，大气辉光放电等离子体（GDP）相较于其他广泛使用的类型（如介质阻挡放电DBD、等离子体射流、电晕放电和微波等离子体）具有独特优势。GDP技术在大气压下产生均匀稳定的放电，在液相系统中活性物种的产生效率更高。此外，GDP工艺保持较低的产品温度（≤ 40 °C），便于连续加工，最大程度降低了电极污染风险，且能耗较低（Warne等人，2021）。这些特性使其特别适合液态食品（包括果汁）的大规模连续灭菌。最近的综述也强调了食品加工业对大气GDP日益增长的关注，指出其能够在高灭活效率和低运营成本之间取得平衡，以适应工业化放大（Sharma等人，2025）。

迄今为止，多项研究报告了NTP技术对苹果汁中Z. rouxii的灭活效果及其潜在机制（Wang等人，2018；Wang等人，2019；Xiang等人，2018）。Xiang等人（2018）证明，在90 W下用DBD等离子体处理140秒，可将苹果汁中Z. rouxii的数量减少约5.0 log??CFU/mL。该研究阐明，等离子体产生的活性物种（如过氧化氢和亚硝酸盐）增加了细胞膜通透性，导致细胞内核酸和蛋白质的大量渗漏。此外，在所测试的条件下，DBD等离子体处理未显著改变苹果汁的总可溶性固形物、还原糖或总酚含量，仅对pH、滴定酸度和部分颜色参数造成轻微变化。Wang等人（2018）开发了一种气相面放电喷雾等离子体系统，在21.3 kV下处理30分钟后有效灭活了苹果汁中的Z. rouxii，扫描电子显微镜（SEM）证实细胞受到严重结构损伤。随后，Wang等人（2019）优化了该喷雾式等离子体反应器的参数，在12°Brix苹果汁中实现了5.60 log??CFU/mL的Z. rouxii数量减少，同时对pH、滴定酸度、还原糖或挥发性风味化合物的影响极小。然而，尽管大气GDP在大规模液态食品加工方面具有优越的适用性，但目前尚无系统研究探讨其对苹果汁中Z. rouxii的灭活效果，现有研究主要集中在DBD和喷雾等离子体构型上（Xiang等人，2018；Wang等人，2019）。

本研究的主要目的是系统研究大气GDP对复原苹果汁中Z. rouxii营养细胞的灭活效果及其潜在机制，同时全面评估其对果汁品质的影响。首先，评估了三株不同来源的Z. rouxii菌株（两株野生分离株和一株培养物保藏参考株）的敏感性，以阐明GDP敏感性可能存在差异。随后，使用这些菌株的鸡尾酒混合物检验了关键工艺参数（包括放电功率、处理时间和工作气体类型）的影响，以确定最佳灭菌方案。然后，通过SEM观察处理后细胞的形态变化，并通过评估膜完整性、核酸和蛋白质的细胞内渗漏以及脂质过氧化来定量细胞膜损伤。这些生物学评估与放电过程中臭氧和亚硝酸盐的产生相关联，以揭示潜在的灭活机制。最后，通过测量感官特性、理化指标（pH、滴定酸含量、TSS含量、还原糖含量、褐变程度和色差）和营养指标（维生素C和总酚含量），分析了GDP处理对苹果汁品质的影响，以全面评估GDP技术用于苹果汁灭菌和保鲜的工业可行性。

**各章节摘要**

**实验试剂和测试菌株**

葡萄糖、琼脂、酵母浸粉和蛋白胨等试剂购自北京澳博兴生物科技有限公司（中国北京）。用于指标检测的分析级化学试剂，包括碘化丙啶、戊二醛、对氨基苯磺酰胺、钾靛蓝三磺酸、N-(1-萘基)乙二胺二盐酸盐、3,5-二硝基水杨酸和2,6-二氯靛酚购自上海源叶生物科技有限公司（中国上海）。所有其他试剂

**GDP对Z. rouxii菌株营养细胞的灭活效果**

GDP对苹果汁中两株野生Z. rouxii菌株（B-WHX-12-52和B-WHX-12-64）和一株培养物保藏参考株（ATCC 2623）营养细胞的灭活效果如图2所示。双因素方差分析表明，处理时间和Z. rouxii菌株均对活菌计数产生显著主效应，且两个因素之间存在显著的交互作用（p < 0.05）。所有三株菌株的活菌计数均随时间呈下降趋势

**结论**

本研究系统评估了GDP对苹果汁中Z. rouxii营养细胞的灭活效果和机制，并评估了其对果汁品质的影响。从浓缩苹果汁中分离的Z. rouxii野生菌株对GDP的抗性显著高于培养物保藏参考株。采用等浓度混合菌株鸡尾酒混合物进行了工艺优化，确定最佳处理参数为50秒

**CRediT作者贡献声明**

龙云：撰写—初稿，软件，项目管理，形式化分析。郭佳雨：可视化，方法论，调查。王建宁：可视化，软件，数据整理。袁一峰：软件，资源。王胡旋：撰写—审阅与编辑，验证，监督，获取资金，概念化。

**利益冲突声明**

作者声明不存在利益冲突。

**致谢**

本工作得到国家自然科学基金（32272446，31801506）、陕西省科学技术厅重点研发计划基金（2025NC-YBXM-148）、陕西省教育厅科学研究计划基金（24JC008）、西安市科学技术局农业技术研究计划基金（21NYYF0058）和陕西科技大学科研启动基金（2016BJ-39）的支持。

龙云 | 郭佳雨 | 王建宁 | 袁一峰 | 王胡旋
陕西科技大学食品科学与工程学院，陕西西安 710021，中国