碳点稳定的、通过配位方式控制的纳米载体实现了具有抗雨性的叶片铁元素输送

《CARBON》：Carbon dot-stabilized and coordination-gated nanocarriers enable rainfast foliar iron delivery

　　•碳点通过配位和自由基衰减来稳定亚铁。•单宁酸-铁壳控制pH依赖性的养分传输。•组分控制决定了碳点的保护和壳层控制的传输。•该载体在模拟降雨后仍保留了72%的降雨前总铁含量。•受控测试将这种载体与水稻叶片铁营养的改善联系起来。

1. 引言
将活性氧化还原微量养分可靠地输送到植物组织中仍然具有挑战性，因为必须同时维持其化学可用性和界面传输。铁对于光合电子转移、叶绿素生物合成以及许多氧化还原酶是必需的；因此，铁缺乏会促进黄化病，限制生物量产生，并可能降低作物产量[[1], [2], [3], [4], [5]]。这个问题在碱性和石灰质土壤中尤为严重，因为这些土壤中铁的溶解度低，根部吸收效率低下[[5], [6], [7]]。叶面施肥可以绕过土壤固定作用，迅速纠正微量养分缺乏，但其效果受到叶片蜡质角质层上液滴停留时间短以及铁在叶片界面被氧化、水解和沉淀的影响[[8], [9], [10]]。目前的叶面铁产品仅解决了部分输送问题。可溶性亚铁盐（如FeSO4）提供了立即可利用的Fe2+，但亚铁状态会导致Fe2+的氧化/减少[11]。螯合制剂（如乙二胺四乙酸螯合铁（EDTA-Fe）可以减少沉淀并提高稳定性，但并不能解决润湿性差、在叶片表面停留时间短或降雨导致的冲刷问题。强结合也可能限制铁的释放，某些氨基多羧酸螯合物的环境持久性仍然是一个值得关注的问题[[12], [13], [14]]。纳米技术和涂层系统可以通过多孔载体、表面活性成分或配位/多酚壳层来调节释放或界面相互作用[[15], [16], [17]]，但大多数平台仍然只优化了单独的步骤，而没有优化Fe2+的保存、养分传输和叶片保留的整个过程。因此，一个集成的叶面铁平台需要在一个材料中具备空间差异化的功能。介孔SiO2被选作限制储存器和结构支架，因为其可进入的孔隙可以容纳铁负载并形成曲折的传输路径[18,19]。碳点被引入作为碳 functional 组分，而不是作为被动添加剂。它们含有氧和氮的表面基团提供了富含电子的位点，可以配位Fe2+，同时它们的自由基衰减活性可能减少局部氧化负担[20,21]。外部TA-Fe金属-酚网络被设计为配位调控的传输模块和富含多酚的叶面界面[[22], [23], [24]]。我们假设将Fe2+和碳点共同限制在介孔支架内可以保护可回收的亚铁部分，而外部TA-Fe层则可以调控传输并改善与叶片表面的接触。在这里，我们通过将Fe2+和碳点共载入氨基功能化的介孔二氧化硅中，然后沉积一层TA-Fe配位层，构建了NFCT（示意图1）。使用包含游离FeSO4、未封闭的NH2-SiO2/Fe2+/CD中间体和不含碳点的TA-Fe封闭制剂的组分控制层次结构，来区分含碳点内部结构对Fe2+保存的贡献与外部配位层对养分传输的贡献。然后对完整配方进行了pH依赖性的可回收Fe2+传输、重复润湿-干燥响应、叶片润湿性、基于总铁的耐雨性、叶片铁积累和植物表现等方面的评估。这种设计将碳点的表面化学性质和氧化还原调控置于材料进步的核心，水稻生理学和田间表现作为应用层面的验证。由此产生的设计原则为其他作物和微量养分系统的后续评估提供了基础。

2. 结果与讨论
2.1 NFCT的制备和表征
NFCT被制成模块化纳米制剂，其中每个组分都解决了叶面Fe2+传输的具体障碍：介孔SiO2提供了养分储存器；表面氨基基团提供了锚定和配位位点；Fe2+和碳点共同限制形成了内部铁保护域；外部沉积了TA-Fe金属-酚层作为配位调控门。在整个制备过程中，分散液和回收粉末在视觉上保持均匀（图1a–d），表明连续的修饰没有产生宏观相分离。

2.2 能量分散X射线光谱（DLS）显示，在胺化、Fe2+/CD加载和TA-Fe沉积后，流体动力学尺寸分布较窄，平均直径约为202-205纳米（图1e–h）。没有明显增加表明这些步骤没有导致DLS可检测分散相内的广泛聚集或颗粒间桥接。保持窄分布的亚微米级颗粒群体对悬浮液的均匀性和可重复的叶面沉积至关重要。从共同的合格前体批次中制备的三个独立最终配方批次在补充表S7中分别进行了评估。

2.3 NFCT的结构和表面化学表征
傅里叶变换红外光谱（FTIR）显示，NH2-SiO2、NH2-SiO2/Fe2+/CDs和NFCT样品均保留了特征性的Si-O-Si振动，并显示出与引入的有机功能相关的额外 bands（图2c）[26,27]。NH2-SiO2/Fe2+/CDs的拉曼光谱中的D和G bands支持了来自碳点的碳质成分的掺入（图2d和图S2）[28]。热重分析（TGA）显示NFCT的总质量损失（58.83%）大于NH2-SiO2/Fe2+/CDs（54.58%；图2e,f和图S3），这与TA-Fe沉积后有机含量的增加一致。因为组成有机成分的热转变重叠，这种差异被解释为有机含量增加的证据，而不是壳层厚度的直接定量测量。N2吸附-解吸分析将颗粒组装与可进入的孔隙率联系起来。NH2-SiO2、NH2-SiO2/Fe2+/CDs和NFCT保持了介孔材料的IV型等温线（图2g）[29]。Brunauer–Emmett–Teller（BET）表面积从NH2-SiO2的308.16 m2 g?1降低到Fe2+/CDs加载后的249.06 m2 g?1，TA-Fe沉积后降至234.16 m2 g?1。报告的主要孔径分别从6.06纳米变为5.23纳米和4.63纳米（图2h和图S4）。这些变化与孔隙网络的占据和外部层对孔隙的部分限制一致。保留的介孔性和降低的孔隙可进入性为未封闭中间体和NFCT的不同传输特性提供了合理的结构基础。开放的孔隙网络会对养分丢失提供有限的阻力，而完全的孔隙阻塞则会限制可进入性。因此，测量的孔隙变化与NH2-SiO2/Fe2+/CDs的持续可回收Fe2+特性以及TA–Fe沉积后观察到的额外传输阻力一起解释（图3b）。

2.4 NFCT的亚铁状态保持和环境响应传输
NFCT的一个核心设计目标是在调节其时间可用性的同时保持可回收的Fe2+[32,33]。增加CD:Fe前体比例提高了释放的Fe2+的比例，而没有显著改变测量的总释放Fe量（图3a和图S6）。这一结果表明，Fe的形态和总Fe传输是相关的，但也是不同的配方属性。在pH 7.0时，游离FeSO4最初产生了较高的可回收Fe2+信号，随后迅速耗尽，这与未保护的Fe2+的氧化和其他水相转化一致（图3b）。NH2-SiO2/Fe2+/CDs保持了持续的可回收Fe2+特性，在120小时后达到了初始可回收量的80.28%，而NFCT达到了57.63%。这种差异支持外部TA-Fe层提供了额外的传输阻力。终点分析仅检测到FeSO4组中有0.25微克的Fe2+，而NH2-SiO2/Fe2+/CDs中有20.07微克，NFCT中有14.40微克（图3c）。因此，仅凭总Fe检测无法区分目标亚铁物种的保存情况。组分比较支持了功能划分，即介孔限制和碳点共加载保护了可回收的Fe2+部分，而外部配位层减缓了养分传输。接下来，在连续浸没和重复润湿-干燥条件下评估了NFCT。在连续浸没过程中，10 mM Cl?（NaCl）和CO32?（Na2CO3）产生了相似的 apparent 可回收Fe2+分布，而pH值有显著影响。24小时后，pH 4.0时的apparent 可回收Fe2+比例为88.0%，pH 5.5时为70.7%，而pH 7.0和8.5时分别为23.5%和26.7%（图3d–f）。由于1,10-菲啰啉测定方法选择性测量Fe2+，这些时间依赖的曲线图整合了外向运输、随后的氧化以及其他物质形态的变化。因此，一阶Higuchi模型和Ritger–Peppas模型仅被用作经验性曲线描述，而非独特释放机制的证明（见图S7、表S1和S2）。总体而言，pH值的依赖性与孔隙尺度运输、配位交换以及Fe2+的转化过程是一致的。用于激发循环实验的葉面露水具有轻微酸性（pH值约为5.5）[34]。每次再湿润事件都会在七个湿润-干燥循环中增加可回收的Fe2+量，从而使得累积分数逐步增加（见图3g）。因此，NFCT残留物在干燥期间仍能保留可释放的Fe2+负荷，并在重新湿润后恢复运输，而不仅仅是在第一次湿润事件时释放。这一结果将连续浸渍观察扩展到了间歇性水合情况，表明Fe2+的可用性取决于湿润频率、湿润期长度以及湿润薄膜的pH值。这种pH效应的机制起源在不同形态和计算中都是一致的。在不同pH值下孵育后的扫描电子显微镜（SEM）观察显示NFCT的形态随pH值而变化（见图3h），这与酸性环境与碱性环境中壳层完整性和通透性的变化一致。为了探究这种反应的分子起源，使用了没食子酸（GA）作为TA的代表性酚类结构，在密度泛函理论（DFT）计算中进行研究[35]。优化后的Fe-GA配位化学计量比和结合能随pH值变化（见图3i及图S8–S11），表明质子化状态调节了金属-酚类结构的配位强度和几何形状[36,37]。这种pH调节的配位平衡为酸性微环境中观察到的壳层软化/松弛提供了机制基础，从而促进了Fe2+的扩散和释放。

除了作为被动碳成分外，CDs还在NFCT的营养储备库内建立了抗氧化保护域[38]。无CD成分对照实验直接证明了这一作用：在测试的储存条件下，NFCT在7天后保留了93.0%的Fe2+，而不含CD的TA-Fe制剂NH2-SiO2/Fe2+/TA-Fe仅保留了46.0%，自由态FeSO4则没有保留任何Fe2+（见图4a）。因此，仅依靠外部TA-Fe配位层是无法解释观察到的亚铁离子的保存效果的，这支持了CDs对Fe2+稳定化的独特贡献。

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图4. CDs对Fe2+的保护结构和抗氧化机制。(a) 不同处理条件下FeSO4、NH2-SiO2/Fe2+/TA-Fe和NFCT随时间变化的剩余Fe2+比例。(b) CDs的透射电子显微镜（TEM）图像。(c) CDs的X射线衍射（XRD）图谱。(d) CDs的傅里叶变换红外光谱（FTIR）。(e) CDs的高分辨率C 1s X射线光电子能谱（XPS）。(f) CDs片段的代表性结构模型及Mulliken原子电荷。(g) 电静力势（ESP）图。(h) 优化后的Fe2+-CDs复合物的DFT能量图，显示结合能和配位键长度。(i, j) 不同浓度下CDs对•OH和•O2?的电子自旋共振（ESR）清除能力。(k) •O2?清除比例的量化结果。(l) 假设的SOD类似催化循环。(m) 假设途径的DFT推导反应能量图（ΔE）。数据以均值±标准差（n=3）呈现。统计显著性通过单因素方差分析（one-way ANOVA）后进行Tukey事后检验判断。ns P > 0.05, *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001。

CDs表现出典型的碳点特征，包括纳米级形态（TEM；图4b）、XRD中的宽范围非晶碳特征（图4c），以及通过FTIR和XPS确认的富含氧和氮的表面基团（图4d, e和图S12）[39]。这些表面官能团为Fe2+提供了化学上合理的结合位点。使用代表性的CD片段进行的DFT计算也证实了这些基团能够与Fe2+配位（图4f, g和图S13）。优化的Fe2+-CD复合物显示出有利的结合能（?231.24 kJ mol?1）和Fe-O键长（1.923 ?）（见图4h及图S14, S15），支持了一种可能减少Fe2+即时化学不稳定性和氧化敏感性的配位途径。

电子自旋共振（ESR）捕获实验表明，CDs以浓度依赖的方式清除了羟基自由基（•OH）和超氧阴离子自由基（•O2?）（见图4i, j和图S16），支持了它们的抗氧化活性[40,41]。此外，DFT推导的反应途径与可能的超氧歧化酶（SOD）类似的路线一致，用于处理•O2?（见图4l, m和图S17）[42,43]。配位计算、ESR信号衰减以及无CD对照实验共同支持了含CD区域的两个互补作用：表面配位可能降低了Fe2+的即时化学不稳定性，而自由基的消除可能减少了局部氧化负担。同时，与未加CD的NH2-SiO2/Fe2+/CDs中间体相比，外部TA-Fe层调控了营养物质的运输速率和环境敏感性。因此，这些数据区分了Fe物种的控制和运输控制，展示了这两种功能在完整NFCT配方中的协同作用。

2.3 NFCT的生物活性和田间农艺特性
下一个问题是NFCT的物理化学性质是否转化为生物学上有意义的Fe输送。使用磷酸盐缓冲盐水（PBS）和市售EDTA-Fe作为对照，评估了NFCT在缺铁水稻幼苗中的生物活性（见图5）。代表性图像显示NFCT显著促进了植物的生长和叶片绿度，在轻微酸性条件下效果最明显（见图5a）。在pH 5.5时，NFCT使茎高度增加到29厘米（PBS组为20厘米），根长度增加到23厘米（PBS组为15厘米），持续30天后（见图5b和c）。此外，NFCT改变了根系结构，使得根的平均直径相对PBS组减小，分别在pH 5.5、7.0和8.5时降至0.362毫米、0.361毫米和0.347毫米，而EDTA-Fe没有显著变化（见图S18）。生理测量进一步支持了Fe营养的改善。NFCT显著提高了土壤植物分析发展（SPAD）叶绿素指数，在pH 5.5-8.5范围内为32-38，而PBS组为14，EDTA-Fe组为25（见图5d），同时新鲜生物量和干生物量也有所增加（见图5e和f）。最重要的是，在pH 5.5下经过NFCT处理后，叶片中的Fe积累量达到160 microg g?1干重（DW），相比之下EDTA-Fe组为65 microg g?1 DW，PBS组为40 microg g?1 DW（见图5g）。

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图5. 不同pH条件下NFCT在水稻幼苗中的生物活性。(a) 在pH 5.5、7.0和8.5条件下，处理30天后PBS、EDTA-Fe和NFCT的剩余Fe2+比例。(b-g) 处理30后的茎高度、根长度、叶绿素指数、新鲜重量、干重量和叶片Fe含量。数据以均值±标准差（n=3）呈现。统计显著性通过单因素方差分析（one-way ANOVA）后进行Tukey事后检验判断。ns P > 0.05, *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001。

pH依赖的Fe2+释放曲线与植物响应之间的对应关系提供了跨尺度证据，将NFCT的物理化学行为与叶片营养输送联系起来。在pH 5.5时，可回收Fe2+的释放量显著高于pH 7.0或8.5（见图3e），NFCT也产生了最高的叶片Fe积累量和最强的叶绿素及生物量响应（见图5d–g）。这表明，配位控制的释放窗口增加了Fe2+在叶片短暂湿润期间被吸收的机会。喷洒溶液的pH值也可能独立影响Fe的形态、液滴与角质层的相互作用以及角质层中的运输。因此，不应将配位门视为生物响应的唯一决定因素。尽管如此，体外可回收Fe2+的释放、叶片Fe积累量和植物表现之间存在一致性。这种一致性将NFCT的纳米级输送行为与农艺相关结果联系起来。

根系结构分析显示，NFCT不仅增加了总根长度，还促进了细根的增殖（见图6a–c）。尽管NFCT是叶面施用的，但地上部分的Fe状态改善伴随着根系的系统重塑。在pH 5.5-7.0范围内，NFCT使细根（<0.5毫米）的比例增加到大约87.1%（见图6c），同时细根对总根表面积的贡献也增加了（见图6d和e）。值得注意的是，在pH 5.5条件下，NFCT使总根体积从PBS组的0.73立方厘米增加到2.8立方厘米（见图6f），根尖数量从443个增加到2071个（见图6g），根分叉数量也显著增加（见图6h）。如补充信息中所定义的，根尖数量代表数字化根网络中检测到的末端点数量，而根分叉数量代表图像分析软件检测到的分支连接点数量。结合细根比例和根表面积的增加，这些变化表明NFCT处理与更加分枝丰富、细根密集的根系结构相关，以及扩展的根-环境界面[44,45]。

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图6. NFCT处理后的根系结构分析。(a) 处理30后的代表性根系照片。(b) 不同直径类别下的根长度分布。(c) 按根长度划分的细根比例。（d) 按面积划分的细根比例。(e) 按面积划分的总根体积。(f) 根尖数量。(g) 根分叉数量。数据以均值±标准差（n=3）呈现。统计显著性通过单因素方差分析（one-way ANOVA）后进行Tukey事后检验判断。ns P > 0.05, *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001。

进行了一项单点、单季的田间验证试验，以初步比较NFCT和市售EDTA-Fe的效果（见图7a）。在测试的地点、季节、水稻品种和施用方案下，未检测到测量到的农艺特性的显著处理差异。土壤植物分析发展（SPAD）叶绿素指数分别为EDTA-Fe的31.6和NFCT的32.2。有效穗数为17和18。穗长分别为26.0厘米和25.5厘米。千粒重分别为23.89克和24.57克；结实率分别为88.00%和88.17%，最终产量分别为633.3公斤/英亩和650公斤/英亩（见图7b–g）。

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图7. NFCT在水稻生产中的田间验证。(a) 关键生长阶段的代表性田间照片。(b-g) SPAD叶绿素指数、有效穗数、穗长、千粒重和最终产量。数据以三个独立田间区块的均值±标准差呈现。处理效应使用随机完全区组模型评估，处理作为固定效应，区块作为区组因素。由于只比较了两种处理，因此直接评估了处理效果。ns P > 0.05。

这些结果提供了在评估条件下的初步田间比较。未检测到处理效果的显著性差异，并不意味着NFCT优于或劣于EDTA-Fe。田间NFCT与EDTA-Fe之间较小的差异可能反映了Fe2+保存、配位调控的运输和抗雨性叶片滞留之间的平衡。因此，进一步评估应结合Fe剂量和施用频率的优化，在不同的环境条件下进行多站点、多季节的试验。过程和性能复杂性的考虑总结在补充说明S1和表S3–S6中。

2.4 Fe制剂与根际细菌群落的关联
为了确定叶面Fe制剂是否与地下协调响应相关，通过独立土壤盆栽实验的样本，使用16S核糖体RNA（16S rRNA）基因扩增子测序分析了根际细菌群落。操作分类单元（OTUs）的重叠分析发现，FeSO4、EDTA-Fe和NFCT处理之间共有5827个OTUs，而FeSO4、EDTA-Fe和NFCT分别有421、472和440个特有的OTUs（见图8a）。广泛的共有OTU池表明，这三种Fe制剂共享了一个共同的根际细菌核心，这与在各种土壤和根相关生境中广泛分布的细菌库一致[[46],[47],[48]]。处理特有的OTUs进一步支持了这种共享细菌池内的制剂相关招募[47,[49],[50],[51]]。

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图8. 不同Fe制剂处理后根际细菌群落的差异。(a) 共有的和特定于处理的OTUs。(b) 基于Bray-Curtis差异性的主成分分析（PCA）。(c) 基于Bray-Curtis差异性的主坐标分析（PCoA）。(d) 生物重复实验中优势细菌门的相对丰度。(e) 三种Fe制剂之间门级分布模式的三元可视化。图b和c中的每个点代表一个独立的生物重复实验（n=3）。

主成分分析（PCA）和基于Bray-Curtis的主坐标分析（PCoA）揭示了整体群落组成中的制剂依赖性模式（见图8b和c）。三种处理含有相似的优势门类，但其相对丰度谱不同（见图8d和e）。FeSO4显示Bacillota、Thermodesulfobacteriota和Acidobacteriota的优势较高，而Pseudomonadota、Nitrospirota、Verrucomicrobiota和Gemmatimonadota的优势较低。EDTA-Fe表现出不同的分布特征，其特点是假单胞菌门（Pseudomonadota）、硝螺菌门（Nitrospirota）、疣微菌门（Verrucomicrobiota）和 Gemmatimonadota 的相对丰度较高。NFCT 并没有产生一个简单的中间分布模式，介于 FeSO4 和 EDTA-Fe 之间。相反，NFCT 样本占据了一个独特的排序空间，并显示出放线菌门（Actinomycetota）、绿弯菌门（Chloroflexota）和 MBNT15 的相对较高丰度，同时硝螺菌门和疣微菌门的丰度也较为中等（图 8b–e）。这些分类群为 NFCT 相关的分布提供了生态背景。硝螺菌门包含能够完成硝化作用的菌系 [52]。产铁载体的根瘤细菌为微生物活动与植物铁吸收提供了已知的途径 [53]。土壤中的碳和氮循环受到空间资源梯度和环境异质性的强烈影响 [54]。农业土壤中的绿弯菌门包含参与碳、氮、磷和氧化还原过程的代谢多样化的菌系 [55]。放线菌门包含具有复杂底物转化能力和与植物相互作用的菌系 [56]。综合来看，观察到的这些分类群定义了一个与可溶性 FeSO4 和螯合 EDTA-Fe 不同的 NFCT 相关的细菌分布模式。制剂依赖性的群落模式表明，铁的化学形式和释放动力学与根际细菌的组装差异有关 [49], [50], [51]。FeSO4 提供了快速可用但氧化还原不稳定的 Fe2+，而 EDTA-Fe 提供了强螯合的铁。相比之下，NFCT 结合了 Fe2+ 的保存和受协调控制的释放。这些差异产生了不同的植物营养反应和与根相关的资源环境。NFCT 相关的细菌分布也与图 6 中观察到的根系重塑相一致。NFCT 增加了细根的比例、根表面积、总根体积、末端根的数量和分支复杂性。由此产生的根-土界面扩展可以提高根源碳输入的空间分布和化学异质性。动态的根系分泌物化学成分和微生物底物偏好是根际群落组装的主要驱动因素 [57]。根系分泌的铁迁移代谢物还可以与微生物相互作用，以改善植物的铁营养 [58]。总之，这些观察结果支持了叶面铁输送改善、系统性根系发育与 NFCT 相关根际细菌分布之间的植物介导的联系。

2.5. 叶面界面性能、耐雨性和储存稳定性
有效的叶面施肥需要水分在蜡质叶表面润湿和保持 [59], [60], [61]。NFCT 相对于水和传统的铁制剂降低了表面张力（图 9a）。在模型蜡质甘蓝叶面上，1 分钟时的表观接触角从水的 138.7° 和 FeSO4 的 129.3° 降至 EDTA-Fe 的 97.8° 和 NFCT 的 75.3°；5 分钟后，NFCT 的接触角为 63.7°（图 9b）。时间分辨图像显示 NFCT 液滴的扩散和停留时间更长，而 FeSO4 和 EDTA-Fe 液滴则更容易从倾斜表面移动（图 9c 和图 S19）。这些观察结果支持 NFCT 在测试的模型表面条件下具有更好的液滴-角质层接触性能。
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图 9. NFCT 的叶面界面性能、耐雨性、储存稳定性和组织分布。(a) 水、FeSO4、EDTA-Fe 和 NFCT 分散液的表面张力。(b) 在模型蜡质甘蓝叶上 1 分钟和 5 分钟时的静态接触角。(c) 模型蜡质甘蓝叶上液滴的时间依赖性扩散行为。(d) 模拟降雨前后叶表面的扫描电子显微镜（SEM）图像。(e) 模拟降雨前后罗丹明 B 的共聚焦荧光图像。(f, g) 降雨前后叶片上的残留 Fe2+ 和总铁。(h) 模拟降雨后的保留效率。(i-k) 在 0、25 和 54°C 下储存 14 天后的 NFCT 稳定性。(l) 叶面施用后的共聚焦组织分布。(m, n) 不同组织中的定量荧光强度和残留量。数据以平均值 ± 标准差（n = 3）表示。统计显著性通过单因素方差分析（one-way ANOVA）后进行 Tukey 的事后检验得出。ns P > 0.05, *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, 和 ****P < 0.0001。
改进的润湿性能转化为更大的抗水去除能力。扫描电子显微镜（SEM）显示，在模拟降雨测试后，NFCT 相关的沉积物在模型蜡质叶表面的持续存在时间比 FeSO4 或 EDTA-Fe 更长（图 9d），这与共聚焦荧光显微镜（图 9e）得到的罗丹明 B 跟踪结果一致。定量分析进一步显示，清洗后 NFCT 处理过的叶片上可回收的 Fe2+ 和总铁的残留量更多（图 9f 和 g）。相应的降雨后保留效率 NFCT 为 72%，而 EDTA-Fe 为 26%，FeSO4 为 12%（图 9h）。模拟降雨的结果将铁的形态变化和养分运输的调节扩展到了叶面界面。通过在降雨后保留更多的制剂沉积物，NFCT 为 Fe2+ 的可用性和随后的叶面吸收提供了更长的时间。NFCT 还表现出良好的储存稳定性。在 0-54°C 下储存 14 天后，其流体动力学尺寸和ζ电位基本保持不变（图 9i 和 j），Fe2+ 的加载率也没有显著损失（图 9k）。视觉检查同样表明其胶体稳定性优于传统的铁溶液（图 S20）。这种稳健性在实际应用中非常重要，因为叶面肥料在储存、运输和田间使用过程中必须保持可处理性。组织分布研究进一步表明，该制剂的分布方式与叶面输送一致，而不是无差别的迁移。在施用荧光标记的 NFCT 相关颗粒后，最强的信号出现在叶片和茎部，而根部的信号较弱（图 9l）。归一化的荧光强度和残留量量化与这种分布一致（图 9m 和 n），表明在测试条件下在地上组织中的有效沉积/保留。结合润湿性和耐雨性数据，这些结果支持第 2.3 节中观察到的生物活性的明显界面机制：NFCT 不仅仅依赖于铁的内在化学性质，而是受益于改善了在冲洗或氧化之前吸收机会的叶面界面特性。
从制剂工程的角度来看，经济性应该基于有效的铁输送量，而不仅仅是制剂的质量。NFCT 的复杂性来自于介孔储库的构建、含有氧化还原保护剂的 CD 域以及 TA-Fe 协调门控机制，还包括相关的纯化、分离和干燥操作。这种架构的功能价值体现在更高的可回收 Fe2+ 可用性、改善的叶面润湿性和比 EDTA-Fe 显著更高的降雨后保留率。因此，工艺开发应优先考虑更高的铁负载量、更低的无营养载体比例、减少的中间分离步骤、溶剂回收以及直接制备可应用的悬浮浓缩物或水分分散粉末。制剂经济学和商业化的评估在补充说明 S1 和表 S3–S6 中提供。14 天的施用前储存研究、7 天的循环润湿测试和单次模拟降雨挑战并不构成在同时变化的光照辐射、温度、相对湿度和重复降雨条件下的多周叶片持久性研究。这样的耦合环境测试将需要更严格地定义田间持久性和施用间隔。

2.6. 载体材料的生物安全性
对于纳米技术的农业应用来说，生物安全性是前提条件 [62,63]。在暴露于载体材料（NH2-SiO2/CDs/TA-Fe）浓度高达 100 ppm 的水稻幼苗中，没有观察到明显的植物毒性（图 10a）。根长、茎高和鲜重的定量测量表明，在测试的浓度范围内没有显著的不良影响（图 10b–d）。此外，SPAD 叶绿素值、相对电导率（REC）和光系统 II（PSII）的最大量子产量（表示为 Fv/Fm）与对照组相比没有统计学上的显著差异（图 10e–g），表明光合作用性能和膜完整性得到保持。
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图 10. 水稻中的植物相容性评估。(a) 暴露于不同浓度的 NH2-SiO2/CDs/TA-Fe 后的 fotografies。(b-g) 根长、茎高、鲜重、SPAD 值、REC 和 Fv/Fm。数据以平均值 ± 标准差（n = 3）表示。统计显著性通过单因素方差分析后进行 Tukey 的事后检验得出。ns P > 0.05, *P < 0.05。
根系分析也与这一结论一致。载体处理没有引起根系结构的有害变化（图 11a–i），表明因此第 2.3 节中观察到的 NFCT 处理后根系的增强增殖应被视为与铁营养改善相关的有益反应，而不是载体的非特异性效应。对于水生生物安全性，成年斑马鱼在测试的暴露浓度范围内表现出接近完全的存活率（图 11j 和图 S21），并且肝和肾组织的苏木精和伊红（H&E）组织学评估未显示出与对照组相比的明显组织病理学异常（图 11k）。总的来说，这些结果表明 NFCT 相关的载体系统在测试的水稻和斑马鱼实验中没有明显的急性不相容性。
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图 11. NFCT 相关载体在水稻和斑马鱼中的生物安全性评估。(a) 代表性根系图像。(b-i) 水稻幼苗的根系结构参数。(j) 斑马鱼的存活率/存活率（每组 n = 10）。(k) 肝和肾组织的代表性 H&E 染色图像。数据 b-i 以平均值 ± 标准差（n = 3）表示。b-i 的统计显著性通过单因素方差分析后进行 Tukey 的事后检验得出。ns P > 0.05, *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, 和 ****P < 0.0001。

3. 结论
开发了一种碳点稳定的、受协调控制的制剂，用于叶面输送氧化还原不稳定的 Fe2+。数据支持功能的分层划分：介孔二氧化硅提供限制和传输路径；内部含有 CD 的域贡献 Fe2+ 的协调和自由基信号的减弱；外部 TA-Fe 网络则提供 pH 响应的传输阻力。在测试条件下，NFCT 在 7 天后保留了 93.0% 的可回收 Fe2+，并在模拟降雨后保留了 72% 的降雨前总铁沉积物。这些材料功能与缺铁水稻中叶片铁含量、SPAD 叶绿素指数、生物量和根系结构的改善有关。仅使用载体的测试进一步表明，在评估的水稻和斑马鱼条件下没有明显的急性不相容性。
单一地点、单一季节的田间试验未发现 NFCT 与商业 EDTA-Fe 在测试的标称铁当量剂量和施用程序下有统计学上的显著差异。相对于 EDTA-Fe，NFCT 在湿润性、降雨后总铁的保留率和控制在温和酸性条件下的叶片铁含量方面表现出明显的优势。筛选级的工艺评估确定了铁负载量、载体比例、纯化强度、溶剂回收和最终剂型是关键的开发变量。提高养分密度同时简化分离、溶剂处理和中间干燥有望降低每单位有效铁处理的成本，并为工艺放大奠定基础。因此，NFCT 应被视为一个在实验室层面得到验证的概念证明，而不是一个准备就绪的生产技术。将其转化为实际应用需要明确规定应用程序、在耦合环境条件下的长期叶片研究、剂量和喷洒频率的优化、多地点和多季节的作物和品种试验、试点规模的工艺验证、最终剂型的开发以及环境命运评估。

4. 实验部分
4.1. 抗氧化 CD 的合成
将柠檬酸（5 g）和 L-抗坏血酸（1 g）溶解在甲酰胺（100 mL）中，并超声处理直到溶液变得清澈。将溶液转移到特氟龙内衬的高压釜中，在 160°C 下加热 4 小时。冷却后，粗产物离心（9000 rpm，10 分钟），并通过 0.22 μm 膜过滤以去除大分子杂质。滤液在去离子水（DI）中透析（分子量截留: 2000 Da）5 天，然后冻干以获得 CD（产率 = 13.5%）。
4.2. Fe2+ 的负载
将 FeSO4·7H2O（0.2 g）、CDs（0.2 g）和 NH2-SiO2（0.2 g）混合在去离子水（100 mL）中，并在室温下搅拌 24 小时以完成加载过程。通过离心收集产物，并用乙醇/水（1:1, v/v）洗涤以去除多余的盐和未结合的物种，然后在 60°C 下真空干燥 12 小时以获得 NH2-SiO2/Fe2+/CDs。使用方程（1）和（2）分别计算 Fe2+ 的负载量（LC）和负载效率（LE）。
(1) LC (%) = Wloaded/Wtotal × 100%
(2) LE (%) = Wloaded/Wadded × 100%
其中 Wloaded、Wtotal 和 Wadded 分别是加载到 NH2-SiO2/Fe2+/CDs 中的 Fe2+ 含量、NH2-SiO2/Fe2+/CDs 的总重量以及添加的 Fe 的重量。
4.3. 控释纳米肥料的制备
将 FeCl3·6H2O（0.25 g）溶解在乙腈（20 mL）中，将 TA（80 mg）溶解在乙腈（20 mL）中。每种溶液在室温下静置 15 分钟，然后以 200 rpm 的速度搅拌 10 分钟。随后加入 NH2-SiO2/Fe2+/CDs（0.1 g），并继续搅拌 45 分钟。通过离心收集产物，用乙腈洗涤三次，再用去离子水洗涤三次，然后在 60°C 下真空干燥 12 小时以获得最终的控释产品，称为 NFCT。
4.4. NFCT 的生物活性
通过监测水稻幼苗的生长、叶面铁积累和根系发育来评估 NFCT 的生物活性。在三叶阶段，NFCT 以 20 μg mL?1 的浓度施用，以 PBS 和商业 EDTA-Fe 肥料（EDTA-Fe，40 μg mL?1）作为对照。两种制剂都标准化到相同的铁当量剂量（5.0 μg Fe 当量·mL?1）。为了评估 pH 响应性能，定期用调整到 pH 5.5、7.0 或 8.5 的水溶液喷洒幼苗。处理后第1天和第30天记录了植株高度，并附上了代表性照片。处理后的第30天，通过数字化根系图像量化了根系结构，包括总根长、根径分布、根表面积、根体积、平均根径、根尖数量和根分叉数量。扫描仪型号、图像分析软件、采集设置、参数定义以及标准化方法均见支持信息中。

**水稻品种及萌发处理**：赣香糯3号种子用2%（v/v）的NaClO进行表面灭菌10分钟，然后用无菌去离子水冲洗五次，并在28°C的黑暗条件下萌发48小时。萌发均匀的种子被转移到水培系统中，培养至三叶期。

**水培条件**：幼苗在Yoshida营养液中生长（前3天使用半浓度，之后使用全浓度），培养舱内光照时间为12小时，黑暗时间为12小时；光照强度为200-300 μmol m?2 s?1；昼夜温差为28/25°C；相对湿度为60-70%。营养液每3天更换一次，在三叶期使用缺铁的营养液。NFCT处理组及对照组通过在三叶期对茎叶进行叶面喷洒来施用相应的处理药剂。

**田间试验**：试验在中国安徽省巢湖市庐江县六墩村的蒋霞粮食种植场进行，采用随机完全区组设计（RCBD）。共测试了两种处理方式：NFCT（20 μg mL?1，以Fe2+当量进行标准化）和对照组（商业EDTA-Fe，40 μg mL?1，以Fe2+当量进行标准化）。每种处理方式包含三个重复次。每个小区面积为3亩（约2000平方米），并设置了缓冲行以减少边缘效应。水稻品种为赣香糯3号，各小区的农艺管理措施（育苗、移栽密度、灌溉及病虫害防治）保持一致。试验涵盖了整个生长周期，包括移栽后阶段（2025年6月17日）、生长期/分蘖期（2025年7月31日）、灌浆期（2025年9月23日）以及成熟/收获期（2025年11月1日）。在田间试验期间，分别在相应的生长阶段或收获阶段测定了SPAD叶绿素指数、有效穗数、穗长、千粒重、结实率和最终产量。田间数据采用随机完全区组模型进行分析，以处理组为固定效应，区组为分组因素。由于只比较了两种处理方式，因此直接根据拟合模型评估了处理组间的差异，无需额外的多重比较程序。统计显著性标准为P < 0.05。

**其他实验细节和支持数据**详见支持信息。

**作者贡献声明**：
- 谭国鹏（Guopeng Teng）：撰写、审稿与编辑、原始稿撰写、数据整理
- 沈博文（Bowen Shen）：项目管理和方法设计
- 元雪（Xue Yuan）：软件开发与概念设计
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- 张嘉（Jia Zhang）：撰写、审稿与编辑
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