皮肤非肽能神经元感知细胞外ATP以增强屏障修复与白色念珠菌宿主防御

《Cell Press Blue》：Cutaneous nonpeptidergic neurons sense extracellular ATP to augment barrier repair and C. albicans host defense

　　

中文翻译
皮肤痛觉伤害性感受神经元能够直接识别病原体入侵并调节宿主免疫应答。神经元对白色念珠菌(Candida albicans)细胞壁成分的识别对于最佳保护性局部17型(type-17)免疫应答的诱导是必要且充分的。研究人员目前报道了一条平行的神经免疫通路，在该通路中，由白色念珠菌和角质形成细胞释放的细胞外ATP(eATP)通过P2X3 ATP受体激活非肽能神经元，包括表达Mas相关G蛋白偶联受体D(Mrgprd)的NP1神经元。消融NP1神经元或P2rx3基因敲除可增加白色念珠菌菌落形成单位(CFUs)，但17型免疫应答的诱导未受影响。相反，转录组学分析揭示了与屏障修复相关的基因和通路发生改变。P2rx3^-/-小鼠在白色念珠菌感染或擦伤后表现出伤口面积增大和经表皮水分丢失增加，并伴随屏障修复延迟。这些数据揭示了一条神经免疫回路，在该回路中，非肽能神经元通过eATP和P2X3感知表皮损伤或感染，从而增强屏障修复进而增强宿主防御。

论文解读

**一、研究背景与科学问题**

皮肤作为机体与外环境之间的重要屏障器官，不仅提供水不透性物理防护，还广泛分布着多种感觉传入神经元亚型。近年来研究发现，躯体感觉神经元，尤其是具有无髓鞘游离神经末梢并广泛投射于屏障组织的伤害性感受神经元，能够直接识别病原体相关分子模式(PAMPs)。其中，表达TRPV1(瞬时受体电位香草酸亚型1)的肽能伤害性感受神经元已被证实可被多种病原体产物直接激活，并通过释放神经肽CGRP调节宿主防御。在皮肤表皮中，还存在一类与肽能神经元不同的非肽能神经元亚型——NP1神经元，其以表达Mrgprd(Mas相关G蛋白偶联受体D)为特征，广泛分支于表皮并在颗粒层终止。尽管NP1神经元在解剖位置上处于检测危险和病原体威胁的最优位置，但关于非肽能神经元直接感知病原体的能力此前尚不清楚。

细胞外ATP(eATP)作为一种古老的、进化上保守的危险信号，可从受损细胞释放并作为损伤相关分子模式(DAMP)触发固有免疫应答。部分病原体如肠道中的大肠埃希菌也可释放eATP；多种白色念珠菌菌株同样能释放eATP，且其释放量与宿主防御效果呈正相关。以往研究已证实皮下注射ATP可激活神经元并诱导疼痛信号，且该过程依赖P2X3受体而非P2X7受体。鉴于P2X3在非肽能皮肤传入神经元中高表达，研究人员推测非肽能神经元可能部分进化用于检测eATP，从而在皮肤中提供一线检测和宿主防御机制。然而，eATP-P2X3-非肽能神经元这一神经免疫通路在白色念珠菌感染及皮肤屏障修复中的具体作用尚属未知，本研究即旨在阐明这一科学问题。

**二、研究结果**

**（一）白色念珠菌来源的ATP可诱导神经元激活**

研究人员首先利用Fura2-AM标记的背根神经节(DRG)神经元培养体系，通过Ca²⁺瞬变检测验证白色念珠菌相关PAMPs对感觉神经元的激活作用。结果显示，热灭活白色念珠菌(HKCA)离心后的上清液(即effluence)可立即诱导约45%的检测神经元产生Ca²⁺内流，而洗涤后的酵母细胞体则无此效应。P2嘌呤能受体拮抗剂PPADS可使响应神经元总数减少44%；用apyrase(ATP二磷酸水解酶)预处理去除ATP后，响应神经元数量减少68%。值得注意的是，HKCA effluence可诱导CGRP释放，但该释放不受apyrase预处理影响，且ATP受体激动剂αβme-ATP不足以诱导CGRPα释放，表明HKCA effluence至少激活两种感觉神经元亚型：释放CGRP的肽能神经元通过不依赖ATP的机制被激活，而另一类神经元（最可能为非肽能神经元）则响应白色念珠菌来源的ATP。

**（二）P2X3介导白色念珠菌来源ATP的识别**

皮肤损伤可导致角质形成细胞释放ATP，研究人员进一步测定了皮肤损伤及感染过程中的eATP水平。结果表明，单纯擦伤即可增加表皮eATP水平，白色念珠菌感染则进一步增加eATP释放。在体内实验中，野生型(WT)小鼠经皮内注射P2X2/3拮抗剂PPADS或A-317491后，皮肤真菌载量显著增加，而P2X4拮抗剂5-BDBD无此效应。P2rx3^-/-小鼠感染白色念珠菌后CFUs较对照小鼠增加约46倍。将白色念珠菌effluence注射至小鼠后爪可诱导机械痛敏，而该反应在P2rx3^-/-小鼠中消失。P2rx7^-/-小鼠与WT小鼠的CFUs无显著差异。RT-qPCR证实皮肤组织中不表达P2rx3。上述结果表明，白色念珠菌感染期间释放的ATP通过P2X3受体增强宿主防御，该受体最可能表达于非肽能神经元。

**（三）NP1神经元为白色念珠菌宿主防御所必需**

通过分析已发表的小鼠DRG单细胞RNA测序数据并结合WGA逆行标记与单细胞qPCR，研究人员发现P2rx3在多种神经元中均有检出，但高表达最为显著地集中在共表达Mrgprd的NP1神经元中。在Mrgprd^TdT小鼠DRG培养体系中，响应HKCA effluence的120个神经元中58%为TdT⁺；apyrase处理后响应神经元数量减少90%，证实ATP的关键作用。研究人员构建了Mrgprd^DTR小鼠，通过白喉毒素(DT)诱导消融NP1神经元后，表皮GFRα2表达神经元显著减少，而热痛觉（由肽能TRPV1神经元介导）保持完整。DT处理的Mrgprd^DTR小鼠经表皮感染白色念珠菌后CFUs较对照组显著升高，证明NP1神经元对最佳白色念珠菌宿主防御是必需的。

**（四）NP1神经元和P2rx3不影响17型免疫应答**

鉴于NP1缺失和P2rx3敲除小鼠的CFUs增加，研究人员预期17型免疫应答可能失调，但结果显示Il23、Il17a和Il22的mRNA转录水平在感染后并未出现显著降低，皮肤中各类免疫细胞数量在Naive和感染状态下均保持相当水平。离体PMA/离子霉素刺激后的T细胞分析显示，CD4 T细胞、TCRγδ T细胞以及推定MAIT细胞和ILCs中的IL-17A表达在对照组与实验组间无显著差异。这表明白色念珠菌宿主防御的降低并非由于17型免疫应答受损。

**（五）转录组分析提示P2rx3^-/-和NP1缺陷小鼠存在屏障修复缺陷**

对WT、P2rx3^-/-、PBS处理的Mrgprd^DTR和DT处理的Mrgprd^DTR小鼠的皮肤进行批量RNA-seq分析发现，感染后P2rx3^-/-和NP1缺失小鼠的差异表达基因(DEGs)存在高度协调性变化。通路富集分析未显示17型或其他炎症反应相关转录改变，而是发现鞘脂代谢和信号通路相关基因表达下调，PI3K/AKT信号通路相关基因表达上调。免疫荧光染色显示，WT小鼠感染白色念珠菌后S1P在角质形成细胞胞质和核内表达显著增强，而P2rx3^-/-小鼠的S1P表达尤其是核定位明显减少。 Western blot分析显示P2rx3^-/-小鼠感染后皮肤中pS6和总S6蛋白水平较WT小鼠增加。此外，RT-qPCR证实白色念珠菌感染的Mrgprd^DTR和P2rx3^-/-小鼠中多个屏障形成相关基因(Flg、Flg2、Ivl、Krt10)表达降低。

**（六）P2X3受体缺失小鼠存在屏障修复缺陷**

为验证神经元ATP感知对皮肤屏障修复的促进作用，研究人员对WT和P2rx3^-/-小鼠进行白色念珠菌感染或单纯擦伤处理。结果显示，在感染后第3天和第5天，P2rx3^-/-小鼠的皮肤破损面积均大于WT小鼠；感染后第3天，P2rx3^-/-小鼠的经表皮水分丢失(TEWL)大幅增加。在无感染的单纯擦伤模型中，P2rx3^-/-小鼠的伤口面积和TEWL同样较WT小鼠显著增加，证实屏障修复缺陷并非继发于白色念珠菌感染。功能获得实验中，WT小鼠擦伤后每日皮内注射MrgprD配体β-丙氨酸，第3天屏障修复显著增强，证明激活MrgprD表达神经元足以增强屏障修复。

**三、讨论与结论**

本研究揭示了一条全新的神经免疫通路：白色念珠菌感染的皮肤中释放的eATP通过P2X3受体激活非肽能Mrgprd表达NP1神经元，进而增强表皮屏障修复和宿主防御。该通路不依赖17型免疫应答的调节，而是通过调控屏障修复发挥作用，与TRPV1表达肽能神经元介导的通路平行运行。eATP作为古老的危险信号，由受损细胞和部分共生微生物释放，本研究进一步确证了角质形成细胞和白色念珠菌来源的ATP均可激活NP1神经元。虽然NP1神经元与角质形成细胞间通讯的具体机制尚未阐明，但转录组分析揭示的鞘脂代谢与PI3K/AKT信号通路变化提示S1P在其中发挥关键作用。该研究拓展了对皮肤神经免疫互作的认识，为理解非肽能神经元在屏障组织稳态维持和抗感染防御中的功能提供了重要理论基础。研究结论表明，通过eATP和P2X3感知表皮损伤或感染的非肽能神经元构成了一条增强屏障修复的神经免疫回路，而屏障修复正是宿主防御的重要组成部分。