《ACS Omega》：Design and Evaluation of PLGA-Based Hybrid Nanoparticles for Nasal Paclitaxel Delivery: Formulation Optimization, Barrier Transport, and Cytotoxicity Assessment
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紫杉醇(PTX)是一种强效抗胶质瘤药物，但其临床应用受限于血脑屏障(BBB)的低穿透性。本研究开发并评价了一种利用载紫杉醇杂交纳米颗粒(HNP–PTX)经鼻内给药实现鼻-脑递送的策略。采用全因子22实验设计优化处方，所得HNP–PTX系统具有单分散分布(<20
紫杉醇(PTX)是一种强效抗胶质瘤药物，但其临床应用受限于血脑屏障(BBB)的低穿透性。本研究开发并评价了一种利用载紫杉醇杂交纳米颗粒(HNP–PTX)经鼻内给药实现鼻-脑递送的策略。采用全因子22实验设计优化处方，所得HNP–PTX系统具有单分散分布(<200 nm)和球形形态。研究评价了壳聚糖包衣的影响，结果显示其改变了表面电荷喷雾特性，但并未显著增强在气-液界面培养的RPMI-2650细胞中的转运。重要的是，所有HNP–PTX处方均保持了鼻上皮屏障完整性，同时相较于游离药物增加了PTX的渗透量。在U87-MG胶质母细胞瘤细胞中的细胞毒性实验显示，其细胞活力降低程度超过紫杉醇(Taxol)和替莫唑胺(TMZ)。这些体外研究结果表明，HNP–PTX作为胶质母细胞瘤治疗的鼻内给药制剂，是一个具有前景的候选方案，值得进一步的体内评价。
**研究背景与意义**
血脑屏障(BBB)在中枢神经系统(CNS)保护中发挥关键作用，但也构成了药物递送至脑组织的重大障碍，严重制约了包括脑肿瘤在内的神经系统疾病的治疗。紫杉醇(PTX)是治疗实体瘤的经典化疗药物，据癌症细胞系百科全书(CCLE)数据，其体外抗脑肿瘤效力约为脑癌标准治疗药物替莫唑胺(TMZ)的1400倍。然而，PTX的临床应用长期受限于其BBB穿透能力不足。已获临床批准的静脉注射PTX制剂(泰素Taxol和白蛋白结合型Abraxane)均无法有效穿越BBB。体外和体内研究已证实P-糖蛋白是阻碍PTX入脑的重要因素。尽管研究表明载PTX纳米载体可在静脉给药后穿越受损BBB并在临床前胶质母细胞瘤(GBM)模型中发挥治疗作用，但以PTX共价结合聚L-谷氨酸纳米颗粒的临床试验却报告了严重的血液学毒性(4级骨髓抑制)且未改善无进展生存期。这些发现凸显了开发新型治疗策略以克服BBB限制、优化递送系统以平衡疗效与安全性的迫切需求。
聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)是FDA批准的生物材料，已被用于构建递送PTX的纳米颗粒。将化学组成不同的材料结合可产生性能优于单一材料的杂交系统。脂质-聚合物杂交纳米颗粒(LPHN)通过整合磷脂、蛋白质、脂质等有机化合物与天然或合成聚合物，可获得更优的生物相容性和系统稳定性。尽管LPHN已在癌症药物递送领域得到广泛研究，但其在胶质母细胞瘤中的应用鲜有探索，特别是经鼻内给药途径的研究更为有限。鼻内给药作为一种非侵入性策略，可通过嗅神经和三叉神经等神经元通路绕过BBB实现药物向脑部的直接递送，经脑脊液分布，从而提高CNS中的药物生物利用度，同时减少系统清除和降解。
本研究开发了由PLGA和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE–PEG)组成的LPHN用于PTX递送(HNP–PTX)，作为鼻内给药的候选系统。研究人员采用22全因子实验设计优化脂质/聚合物比例和表面活性剂浓度，以粒径、多分散指数(PDI)和表面电荷为响应变量；对优化后的HNP装载PTX并评价药物掺入对理化性质的影响；利用气-液界面(ALI)模型培养的RPMI-2650细胞评价不同HNP–PTX处方的PTX渗透能力；通过跨上皮电阻(TEER)和细胞旁通透性实验评估屏障完整性；最后在人胶质母细胞瘤U87-MG细胞和鼻上皮RPMI-2650细胞中评价HNP–PTX的细胞毒性。该研究据研究人员所知是首批将因子优化、喷雾装置测试和ALI转运模型相结合用于鼻-脑递送载PTX杂交纳米颗粒的研究之一。该论文发表于《ACS Omega》。
**主要技术方法**
研究人员采用的关键技术方法包括：①利用22全因子实验设计优化纳米颗粒制备参数，以粒径和Zeta电位为响应变量建立统计模型；②采用纳米沉淀联合溶剂蒸发法制备PLGA/DSPE–PEG杂交纳米颗粒并装载PTX，通过超滤离心纯化，部分处方以低黏度壳聚糖(CS)进行表面包衣；③运用动态光散射(DLS)、纳米颗粒追踪分析(NTA)、透射电子显微镜(TEM)、差示扫描量热法(DSC)和热重分析(TG)对纳米颗粒进行全面表征，并通过高效液相色谱(HPLC)测定包封率；④使用Malvern Spraytec激光衍射系统评价鼻喷雾剂雾化性能，并在Koken透明硅胶人鼻模型中测定鼻腔沉积分布。
**研究结果**
**脂质/聚合物比例和表面活性剂浓度对杂交纳米颗粒的影响**
通过22全因子设计制备四种处方组合并重复三次，方差分析表明模型对PLGA 50:50的粒径和Zeta电位均显著(p < 0.05)。脂质/聚合物比例是显著影响因素，强烈影响粒径(p < 0.0001)和Zeta电位(p = 0.0023)，而表面活性剂浓度增加未显著影响这些响应。所有处方平均粒径均低于200 nm，Zeta电位呈高表面电荷特征。选择最低水平表面活性剂和聚合物/脂质比例的HNP处方作为优化处方，验证实验实测粒径146.3 ± 5.7 nm(预测140.6 nm)，Zeta电位-35.7 ± 0.5 mV(预测-29.9 mV)，确认了优化模型的充分性。
**HNP–PTX的表征**
以脂质/聚合物比例0.1、PTX 0.5 mg/mL和不同表面活性剂浓度制备载药纳米颗粒。随表面活性剂浓度增加，PTX包封浓度和包封率显著降低(p < 0.0001)，提示较高表面活性剂可能通过增强药物在纳米颗粒形成过程中外相的溶解而损害药物包载。最终选择最低脂质/聚合物比例(1 mg DSPE–PEG2000和10 mg PLGA)、最低表面活性剂浓度(0.1% w/v)和PTX 0.5 mg/mL的处方作为HNP–PTX。PDI为0.098 ± 0.021，表明系统单分散；Zeta电位为-31.9 ± 6.6 mV，表明表面高电荷有利于物理稳定性。DLS测得平均直径171.8 ± 1.2 nm，NTA测得145.3 ± 1.2 nm，NTA显示90%纳米颗粒小于200 nm，有利于穿透鼻黏液屏障。TEM显示核-壳结构、规则球形、直径小于200 nm，暗色外层为脂质壳层包裹明亮PLGA核心。
**热学性质评价**
通过DSC和TG对单一组分及纳米制剂进行热分析。PTX在212.58 °C出现熔融吸热峰，热稳定性可达216 °C；DSPE–PEG2000在约50 °C出现熔融特征吸热事件；PLGA在25–55 °C出现玻璃化转变(Tg)，约350 °C出现聚合物分解吸热峰。HNP–PTX中未观察到药物熔融峰，表明PTX以包封形式存在；各组分间无明显热行为改变，表明组分间具有良好的相容性。含PTX的纳米颗粒较空白制剂具有更优的热稳定性。
**壳聚糖包衣**
为考察表面电荷对HNP–PTX体外行为的影响，以5–250 μg/mL不同浓度低黏度壳聚糖对纯化后纳米颗粒进行包衣。粒径随CS浓度升高至50 μg/mL而增大，在更高浓度(125和250 μg/mL)下反而减小，中间浓度时Zeta电位绝对值较低可能导致静电稳定不足而促进聚集。Zeta电位随CS浓度增加逐步向正值转变，证实阳离子CS在纳米颗粒表面的吸附。选取三种处方进行后续评价：未包衣HNP–PTX(负电荷，-31.9 ± 6.6 mV)、HNP–PTX-CS5(近中性，-4.7 ± 0.7 mV)和HNP–PTX-CS250(正电荷，+35.7 ± 2.3 mV)。
**喷雾特征和鼻腔沉积模式**
通过VP7 Aptar鼻阀递送的各HNP–PTX处方均产生Dv50 < 150 μm的雾滴尺寸，表明适合鼻腔递送。高浓度CS包衣的HNP–PTX-CS250表现出显著更大的Dv10、Dv50和Dv90值，与黏度从未包衣的1.32 ± 0.05 mPa·s升高至CS250的2.26 ± 0.01 mPa·s有关，较高黏度阻碍了雾化。尽管雾滴尺寸增加，但HNP–PTX-CS250在Koken透明鼻模型中嗅区的沉积显著高于未包衣HNP–PTX，且无制剂滴入喉部，表明鼻腔内保留良好。壳聚糖的黏膜黏附特性可能为鼻-脑药物递送提供优势。
**鼻上皮屏障完整性评价**
经4小时暴露后，所有HNP–PTX处方均未引起TEER相对基线的显著变化(p > 0.05)。荧光素钠(Flu-Na)细胞旁通透性实验显示对照组与处理组间无显著差异(p > 0.05)，表明HNP–PTX处方不破坏紧密连接，在测试剂量下保持了RPMI-2650鼻上皮细胞的屏障特性。该发现支持开发安全有效的鼻内PTX递送系统的可行性，但需进行超过4小时的慢性暴露研究才能作出转化性论断。
**气-液界面模型中的药物沉积与转运评价**
在ALI条件下培养的鼻上皮细胞中评价PTX转运。所有HNP–PTX处方相比游离PTX溶液均显示显著更高的PTX跨上皮转运量。游离药物组细胞内PTX积累显著更高，而纳米颗粒组基底侧转运比例更高，说明递送系统促进药物穿越细胞屏障而非仅滞留于细胞内。HNP–PTX-CS250仅在30分钟时间点显示较HNP–PTX更快的PTX转运(p = 0.0334)，各HNP–PTX处方间未检测到整体转运速率的显著差异。壳聚糖未显著改善药物跨鼻上皮转运，提示增加转运的主要驱动力是纳米颗粒平台本身，聚山梨酯80和PEG链可能提供了黏液穿透效应。
**细胞毒性研究**
在U87胶质母细胞瘤细胞中，未包衣HNP–PTX呈剂量依赖性降低细胞活力，IC50为0.27 nM；HNP–PTX-CS5的IC50为0.39 nM，与未包衣处方相当；HNP–PTX-CS250的IC50为12.77 nM，细胞毒性较低。HNP–PTX的IC50约为Taxol(游离PTX)的2倍低，表明纳米颗粒介导的递送增强了PTX的抗癌活性；较TMZ的IC50显著更低，表明其抗胶质瘤活性优于临床标准药物。在RPMI-2650鼻上皮细胞中，未包衣HNP–PTX的IC50为20.12 μM，未载药HNP无显著细胞毒性，证实效应归因于PTX。HNP-PTX对U87细胞的高度敏感性结合对鼻上皮细胞的耐受性，表明其具有选择性细胞毒性，支持鼻内给药的安全性。CS包衣在该评价条件下未增强PTX的体外抗肿瘤疗效。
**结论与意义**
本研究通过22全因子设计优化了载PTX的PLGA/DSPE–PEG杂交纳米颗粒(HNP–PTX)，获得单分散、核-壳结构、粒径小于200 nm且热稳定性良好的颗粒。所有处方均产生适合鼻腔递送的喷雾(Dv50 < 150 μm)并在鼻模型中沉积而无喉部滴漏。HNP–PTX在不影响TEER或Flu-Na通透性的条件下增加了PTX相对于游离药物的转运。在U87细胞中，HNP–PTX较Taxol和替莫唑胺具有更强的细胞毒性，同时对RPMI-2650细胞保持可耐受性。尽管HNP–PTX-CS250显示增强的嗅区沉积，但其体外抗肿瘤活性低于未包衣处方。总体而言，未包衣HNP–PTX处方在理化性质、鼻腔沉积、上皮转运和生物活性之间提供了最优平衡。这些发现支持其作为鼻内紫杉醇递送候选药物的潜力，并为在胶质母细胞瘤模型中开展进一步临床前体内研究以评价其疗效和安全性提供了依据。
