睾丸类器官中的镉毒性：用于睾丸毒理学体外模型验证的研究

《Toxicologic Pathology》：Cadmium Toxicity in Testis Organoids: Validation of an In Vitro Model for Testicular Toxicology

　　

摘要翻译：
环境有毒物质越来越多地被认定与男性生殖系统疾病相关，凸显了开发具有生理相关性的体外睾丸模型用于毒理学检测的必要性。研究人员此前开发了一种睾丸类器官系统，该体系能够重现天然组织的关键结构和内分泌特征；然而，其用于毒理学应用的适用性仍需验证。本研究选用镉——一种已被充分表征的环境重金属和睾丸毒物——作为阳性对照，以评估模型反应性。将睾丸类器官暴露于递增浓度的镉（0.01、1、10和100 μM）中，以评估剂量依赖性毒理学效应。定量检测了类器官内镉的生物蓄积量，并评估了多项终点指标，包括睾丸细胞组装、生精索形成、细胞凋亡/坏死、生殖细胞数量、DNA损伤、细胞增殖和内分泌功能。镉以浓度依赖性方式蓄积，在10和100 μM浓度下蓄积量更高。在这些浓度下，镉暴露减少了生精索形成、生殖细胞数量和细胞增殖，并降低了睾酮和雌二醇的产生，同时增加了细胞凋亡/坏死和DNA损伤。仅在100 μM浓度下观察到睾丸细胞组装被破坏。综上所述，这些发现证明了剂量依赖性毒性反应，并支持将该睾丸类器官系统用作生殖毒理学和环境有毒物质评价的相关体外模型。

论文解读文章：

一、研究背景与目的

男性生殖系统疾病已成为日益严峻的全球性健康问题。据统计，全球约10%至15%的夫妇面临不孕不育问题，其中男性因素约占近半数。多项大型荟萃分析显示，1973年至2018年间，亚洲、非洲、澳大利亚、欧洲和美洲等多个大陆的精子数量出现大幅下降。与此同时，自20世纪70年代以来，睾丸癌的发病率持续上升，尤其是在北欧、西欧和北美地区。虽然这些趋势的潜在原因尚未完全阐明且可能涉及多种因素，但环境有毒物质的暴露被认为是导致男性生殖健康恶化的重要因素之一。

越来越多的毒理学证据表明，许多环境化学物质可对睾丸发育和功能产生不利影响。这些化合物可能干扰细胞分化、内分泌信号传导以及睾丸细胞群之间的相互作用，最终损害精子发生和生殖能力。与男性生殖毒物相关的主要病理机制包括睾丸细胞发育和功能改变、激素产生紊乱、氧化应激、基因毒性损伤以及炎症反应。在关键发育窗口期发生的此类干扰可能对睾丸结构和生育能力产生长期后果。

睾丸发育是一个高度协调的过程，涉及复杂的形态学变化和多种细胞类型之间的相互作用。在早期胚胎发育阶段，支持细胞组织形成包含未成熟生殖细胞的睾丸索，这些结构随后发育为生精小管。这些索状/管状结构周围环绕着包含血管和产生雄激素的间质细胞的间质组织。这些细胞群体之间的正常通讯和充分的内分泌信号传导，特别是雄激素的产生，对于正常的睾丸形态发生和随后的生殖功能至关重要。早期发育阶段的睾丸对毒性损伤特别敏感。在胎儿期和出生后早期，血睾屏障尚未完全建立，发育中生物的未成熟解毒系统对化学暴露的保护作用可能有限。

传统生殖毒理学研究通常依赖体内动物模型，这些模型能提供关于毒物全身反应的有价值信息。然而，这类研究可能受到高成本、伦理考量和实验变异性的限制，在研究睾丸发育毒性效应时尤为具有挑战性。因此，体外模型代表了重要的补充方法。其中，睾丸类器官系统已成为有前景的工具，因为它们可以在受控实验室条件下捕捉睾丸结构、细胞间相互作用和内分泌功能的某些方面。研究人员此前开发了一种仿生睾丸类器官模型，该模型能够重现天然睾丸组织的基本组织结构、内分泌活性和体细胞成熟特征。选择猪睾丸组织生成类器官是因为猪与人类在解剖学、生理学和发育上具有相似性，是宝贵的转化模型。此外，新生睾丸组织在常规仔猪阉割后易于获取，为原代细胞提供了实用且一致的来源。与成年组织相比，新生睾丸细胞具有更大的发育可塑性和自组织能力，有利于类器官形成和体外组织重组。

为了有效利用类器官系统进行毒理学研究，建立定义明确的阳性毒性对照至关重要，该对照应能产生可预测的病理反应。镉是一种广泛存在的环境重金属污染物，是适合此目的的候选物质。已有研究表明，镉可在睾丸组织中诱导一系列不良效应，包括DNA损伤、氧化应激、多种睾丸细胞类型凋亡以及睾酮产生抑制。本研究旨在评估镉暴露对睾丸类器官发育和功能的影响，以组织病理学读数作为评估该模型毒性的主要手段。具体而言，研究人员检查了睾丸细胞组装、生精索形成以及细胞反应（包括活力、增殖、凋亡和DNA损伤）的剂量依赖性变化，并使用组织学和辅助分析进行检测。此外，分别使用多重内分泌分析和彗星实验评估了内分泌功能和基因毒性。这些反应的特征将有助于确定该类器官平台作为生殖毒理学体外模型和评估环境毒物对睾丸发育影响的适用性。

二、研究技术与方法

本研究采用多种关键技术方法。睾丸组织来源于1周龄约克郡杂交仔猪（Camborough-22 × Line 65；PIC Canada，温尼伯，马尼托巴省，加拿大），在草原猪研究中心进行无菌阉割后获取。所有动物使用均按照萨斯喀彻温大学机构动物护理和使用委员会批准的方案进行。每个独立生物学重复使用来自6头仔猪的睾丸合并生成类器官。每个实验包含三个生物学重复，每个处理组至少包含两个细胞聚集体/类器官作为技术重复。研究人员使用三步酶消化法从新生仔猪睾丸中制备单细胞悬液，该方法的富集生殖母细胞比例约为40%。睾丸类器官采用气液界面培养方法生成，将分离的睾丸细胞以0.8×10⁶细胞/孔的密度接种于U形底96孔板中培养24小时形成聚集体，随后转移至1.5%琼脂糖凝胶支持物上建立气液界面环境。为促进内分泌产生，从第6天开始在培养基中添加人绒毛膜促性腺激素（hCG；4.5 IU/mL）和卵泡刺激素（FSH；20 IU/L）。镉暴露使用氯化镉（CdCl₂），最终浓度为0.01、1、10和100 μM。对照组包括阴性对照（NC，无镉处理）和抗衡离子对照（CC，100 μM氯化钙处理）。主要分析方法包括：电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）用于定量类器官中的镉生物蓄积；组织学处理和免疫组织化学（IHC）用于检测裂解型caspase 3（凋亡标志物）、UCHL1（生殖母细胞/生殖细胞标志物）和Ki67（细胞增殖标志物）；碱性彗星实验用于评估DNA损伤；多重内分泌分析用于测量睾酮、雌二醇和孕酮水平；QuPath软件用于定量组织学参数。统计学分析采用单因素方差分析（ANOVA）和Jonckheere-Terpstra趋势检验。

三、研究结果

1. 镉对睾丸细胞组装的破坏

研究人员在初始聚集阶段（第1天和第3天）检查了镉对睾丸细胞组装的影响。阴性对照、抗衡离子对照和低剂量镉组（1和10 μM）观察到正常的细胞聚集，表现为完整且粘附的细胞球体形成。相比之下，100 μM镉处理显著损害了聚集体形成，导致更小且粘附性较差的细胞组装体。定量分析证实，100 μM镉组的聚集体面积与对照组和低剂量处理组相比显著减少（P < .05）。此外，所有组的聚集体大小从第1天到第3天均随时间减小（P < .05）。

2. 睾丸类器官中的镉生物蓄积

在持续暴露于0.01、1、10或100 μM镉3周后评估类器官中的镉蓄积。阴性对照组类器官的基础镉水平为2.11 ± 0.49 μmol/kg。1 μM镉暴露显著增加了组织镉浓度。在1和10 μM处理组之间观察到进一步显著增加（P < .05）。然而，10和100 μM组之间未检测到显著差异（P > .05），表明在高暴露水平下镉摄取出现平台期。

3. 镉对类器官生精索结构和细胞活力的细胞毒性效应

通过组织学评价和生精索形成、坏死和凋亡的定量分析评估镉对睾丸类器官的细胞毒性效应。3周后，对照类器官显示出良好的区室化结构和清晰明确的睾丸索。相反，暴露于高浓度镉（100 μM）的类器官表现出广泛坏死，其特征为无定形嗜酸性区域，缺乏细胞细节，含有大量退化细胞和坏死细胞碎片。形态计量分析表明，高浓度镉（10和100 μM）显著降低了生精索相对面积，并增加了坏死相对面积（P < .05）。裂解型caspase 3免疫染色证实高浓度镉暴露的类器官中凋亡增加，10和100 μM处理组的凋亡相对面积显著大于对照组和低剂量组（P < .05）。

4. 镉对生殖细胞数量的影响

使用UCHL1免疫染色评估镉对生殖细胞数量的影响。定量分析显示，与对照组相比，暴露于0.01至100 μM镉浓度范围的类器官中生殖细胞数量显著减少（P < .05），表明生殖细胞对镉暴露具有敏感性。

5. 镉对细胞增殖的影响

使用Ki67免疫染色评估类器官内的细胞增殖。对照类器官含有丰富的增殖细胞，特别是在发育中的生精索结构内。定量分析表明，10和100 μM镉处理类器官中的增殖细胞数量与对照组和低剂量处理组相比显著减少（P < .05）。

6. 镉的基因毒性效应

使用碱性彗星实验评估镉暴露的潜在基因毒性效应。暴露于较高浓度镉（10和100 μM）的类器官表现出显著增加的DNA损伤，表现为更长的彗星尾长、增加的尾部DNA百分比和更高的尾矩（P < .05）。

7. 镉的内分泌干扰效应

通过测量类器官培养基中的类固醇激素浓度评估镉的内分泌干扰效应。暴露于100 μM镉的类器官与对照组和低剂量处理组相比，睾酮和雌二醇分泌显著降低（P < .05）。相比之下，孕酮水平未受镉暴露的显著影响（P > .05）。

四、讨论与结论

镉是一种广泛存在的环境污染物，可在包括肝脏、肺和生殖器官在内的多个器官中蓄积并诱导细胞毒性损伤。虽然确切的机制尚不完全清楚，但氧化应激增加、细胞损伤和基因表达改变已被涉及镉诱导的胚胎毒性。在本研究的类器官系统中，解离的睾丸细胞经历聚集和空间重组形成索状和间质结构，在形态上类似于体内睾丸器官发生过程中发生的细胞重组。研究人员观察到100 μM镉浓度下睾丸细胞组装出现显著破坏，而≤10 μM的浓度未显著影响细胞组装。高浓度下观察到的破坏可能归因于镉对睾丸细胞的细胞毒性作用。

关于镉浓度与体内数据的比较，疾病控制与预防中心（CDC）数据显示一般人群的血镉水平为0.2至0.4 μg/L（0.001-0.003 μM）。大鼠睾丸的正常镉水平约为1.07 μmol/kg。本研究发现对照睾丸类器官中的镉浓度为2.11 ± 0.49 μmol/kg，与报道的正常大鼠睾丸值相当。镉水平在10 μM处理组出现平台期，可能机制包括镉结合能力饱和、细胞死亡增加限制进一步摄取，或由细胞外镉暴露驱动的急性毒性效应。

镉已被报道可干扰支持细胞增殖、产生活性氧、引起细胞凋亡和生殖细胞丢失，并导致间质细胞DNA损伤和睾酮分泌受损。本研究中，高浓度镉（10和100 μM）以剂量依赖性方式损害生精索形成、抑制细胞增殖、减少生殖细胞数量并诱导坏死和细胞凋亡。值得注意的是，0.01 μM镉水平约为血镉阈值水平的四分之一，但仍能显著降低生殖细胞数量，表明生殖细胞在亚毒性水平下对镉暴露敏感。

内分泌干扰是近年来的主要关注焦点。镉通过多种机制干扰睾丸内分泌功能，包括对睾丸细胞的直接细胞毒性、诱导凋亡和产生氧化应激。本研究中，高浓度镉（100 μM）显著抑制睾酮和雌二醇产生，这可能归因于镉诱导的细胞死亡，特别是间质细胞死亡。

本研究存在一些局限性。类器官样本较小，使得样本处理和组织学加工具有技术挑战性。类器官培养在近距离时可能融合，引入变异性。组织学评价需要训练有素的人员，可能耗时且具有固有主观性。类器官内的生殖细胞数量固有地低于完整睾丸组织，这可能限制生殖细胞定量在该模型中的敏感性、准确性和转化相关性。此外，虽然镉暴露诱导类器官内细胞死亡逐渐增加，但最易受毒性影响的特定细胞群体仍不确定。裂解型caspase 3免疫反应性的解释应结合组织形态和更广泛的生物学背景。最后，本研究仅评估了镉一种毒物。

结论：本研究支持将该类器官系统用作毒理学研究的体外平台，证明类器官以剂量依赖性方式对镉诱导的毒性损伤作出反应。该系统可评估多种终点，包括睾丸细胞组装、睾丸索形成、细胞坏死、凋亡、生殖细胞数量、DNA损伤、细胞增殖和内分泌产生。尽管存在重要局限性，特别是在生殖细胞数量低和缺乏精子发生分化方面限制了其用于专门针对生殖细胞毒性的研究，但该体外模型为研究毒物对睾丸体细胞发育和内分泌功能的影响提供了有价值的平台。此外，该类器官模型作为体内研究前评估候选毒物或药物的预筛选工具具有强大潜力。与传统的动物模型相比，该系统在速度、成本、实验一致性和环境控制方面具有优势。猪模型由于组织可及性和可用性更高，比基于人类睾丸组织的系统具有实际优势。这些优势共同可能有助于未来更高效的化学品安全检测。