整合单细胞与基因组分析揭示NMB通过代谢重编程和免疫逃逸驱动食管鳞状细胞癌的转移适应

《Frontiers in Cell and Developmental Biology》：Integrative single-cell and genomic analysis reveals NMB as a driver of metastatic adaptation in esophageal squamous cell carcinoma via metabolic rewiring and immune evasion

　　

背景：食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma, ESCC）具有高死亡率，转移是患者死亡的主要原因。神经介素B（neuromedin B, NMB）在多种癌症中促进肿瘤发展，但其在ESCC转移中的作用尚不清楚。

方法：研究人员整合了来自配对原发灶和转移灶ESCC病变（GSE309392）的单细胞转录组数据，以及来自TCGA和GSE53624的批量转录组队列。进行了计算机模拟基因扰动、配体-受体通讯分析和单细胞预后模型构建，随后通过siRNA介导的NMB敲低在TE-1和KYSE30细胞系中进行功能验证。

结果：NMB被确定为转移性ESCC病变中富集的关键基因，其高表达与氧化磷酸化通路基因和醛酮还原酶家族抗氧化酶（AKR1C1、AKR1C2、AKR1B10）的协同上调相关。基因组分析显示，NMB高表达肿瘤携带更高的克隆突变负荷，且NFE2L2激活突变频率显著增加（23% vs. 8%，P = 0.04）。计算机模拟敲除和相关性分析确定AKR1C1为NMB的下游效应因子。NMB表达与CD8⁺ T细胞和活化NK细胞浸润呈负相关。CellChat分析揭示了NMB阳性细胞与单核细胞之间通过TGM2–ADGRG1轴的通讯，并特异性地检测到IFNG信号。在单细胞预后模型中，NMB阳性细胞占高风险组的50%，而仅占低风险组的20%。基于TCGA的生存分析表明，NMB高表达与较短的总生存期相关（HR = 2.98，P = 0.03）。体外NMB靶向RNA干扰显著抑制TE-1和KYSE30细胞的增殖、集落形成和迁移。CMap筛选确定内皮素-PDE5-cGMP轴为潜在治疗靶点。

结论：NMB是ESCC转移适应的关键驱动因子，通过基因组进化和免疫重塑赋予肿瘤细胞在转移定植过程中的生存优势，而代谢适应是基因组改变的下游后果。

研究背景：食管鳞状细胞癌（ESCC）是食管癌的主要组织学亚型，约占全球病例的85%，预后极差，诊断后5年生存率不足20%。远处转移是导致患者预后不良和治疗失败的首要原因。ESCC的转移进展伴随肿瘤细胞异质性加剧和肿瘤微环境（TME）的动态重塑，基因组不稳定性是驱动这种高异质性的基础。TP53突变率在ESCC中高达60%–90%，并常伴有NOTCH1、NFE2L2和CDKN2A等基因的反复突变。这些突变可产生肿瘤特异性新抗原，调节程序性死亡配体1（PD-L1）等免疫检查点分子，并重塑TME。TME中大量免疫抑制细胞（如调节性T细胞、髓源性抑制细胞和M2型肿瘤相关巨噬细胞）浸润，抑制CD8⁺ T淋巴细胞和自然杀伤（NK）细胞的抗肿瘤功能，从而为肿瘤免疫逃逸和远处定植创造条件。尽管已知免疫抑制性TME驱动ESCC转移，但其上游调控因子仍不清楚。神经介素B（NMB）是一种分泌型生物活性多肽，属于铃蟾肽样肽家族，通过其G蛋白偶联受体NMBR发挥作用。已有研究证实NMB在宫颈癌、结直肠癌等实体瘤中具有促癌作用，但其在ESCC转移中的角色尚未明确。因此，研究人员旨在鉴定与基因组改变和肿瘤微环境相关的ESCC潜在分子靶点。

研究人员开展了什么研究，得出什么结论，有什么重要意义：研究人员整合了配对原发灶和转移灶的单细胞转录组数据（GSE309392）与TCGA和GSE53624批量转录组队列，通过计算机模拟基因扰动、配体-受体通讯分析、单细胞预后模型构建和体外siRNA敲低验证，发现NMB是转移性ESCC病灶中富集的关键基因，其高表达与氧化磷酸化通路基因上调及AKR1C1等抗氧化酶表达相关，并与免疫抑制微环境相关。结论为NMB是ESCC转移适应的关键驱动因子，通过基因组进化和免疫重塑赋予肿瘤细胞在转移定植中的生存优势。该论文发表在《Frontiers in Cell and Developmental Biology》。

主要技术方法：研究人员使用了来自GEO数据库GSE309392的6例ESCC单细胞转录组样本（包括3例原发肿瘤和肺转移病灶），以及TCGA-ESCA和GSE53624两个批量转录组队列。主要方法包括：单细胞数据预处理和Harmony批次校正、inferCNV恶性细胞鉴定、Slingshot轨迹分析、decoupleR转录因子活性分析、limma差异表达分析、Maftools基因组突变分析、SIDISH单细胞预后风险模型、CIBERSORT/xCell/MCP-counter/ESTIMATE免疫浸润分析、scTenifoldKnk计算机模拟基因敲除、CellChat细胞通讯分析、CMap药物敏感性预测，以及TE-1和KYSE30细胞系中的siRNA敲低功能验证。

研究结果：

3.1 单细胞转录组图谱构建与ESCC细胞类型鉴定：对6例ESCC样本进行质量控制后，经Harmony批次校正和聚类，通过标志基因注释定义了9种主要细胞类型。inferCNV分析显示恶性上皮细胞具有更高的拷贝数变异（CNV）评分，可作为区分肿瘤和非肿瘤细胞的依据。

3.2 鉴定具有侵袭性恶性特征的转移性肿瘤亚群：对全部恶性细胞重新聚类并构建分化轨迹，鉴定出3个谱系。转移性肿瘤细胞独立聚类后收敛为单一分化谱系，其中亚群0是原发肿瘤细胞的进化终末状态，具有最高的NMB富集比例，并高表达抗氧化基因AKR1C1、AKR1C2和AKR1B10。

3.3 NMB是ESCC转移的风险因子：转录因子表达谱显示亚群0表达干性和上皮-间质转化相关的转录因子ASCL2和SOX4。将预后相关亚群特征基因、bulk上调基因与ImmPort免疫相关基因取交集，确定NMB为预后相关的免疫相关基因，且NMB高表达细胞中NFE2家族转录因子活性增强。

3.4 SIDISH预后风险评分将NMB高表达鉴定为预后不良的风险因子：SIDISH模型将430个细胞划分为高风险组，9,109个细胞为背景组。高风险组患者生存缩短（HR = 4.12）。NMB阳性细胞在高风险组占50%，在低风险组占20%，差异显著。Kaplan-Meier分析证实NMB高表达与较短总生存期相关（HR = 2.98，P = 0.03）。

3.5 NMB高表达与独特的基因组突变谱相关：TCGA-ESCC数据中，NMB高表达组的总肿瘤突变负荷显著升高（P = 0.0454），克隆突变比例也更高（44.8% vs. 39.7%，P < 0.001）。NMB高表达组NFE2L2突变频率显著增加（23% vs. 8%，P = 0.04），且NMB表达在NFE2L2突变样本中更高。

3.6 NMB相关功能富集及AKR1C1作为下游效应因子的鉴定：NMB阳性恶性细胞的差异表达基因富集于氧化磷酸化、线粒体呼吸链复合体、ATP生物合成和活性氧代谢等通路。计算机模拟NMB敲除扰动多个肿瘤相关基因，KEGG富集指向活性氧代谢。将ROS相关基因与NMB相关基因取交集，确定AKR1C1为核心下游效应因子，且bulk RNA分析显示NMB与AKR1C1表达显著正相关（Pearson R = 0.37，P = 0.00019）。

3.7 NMB表达及其在塑造免疫抑制肿瘤微环境中的作用：CellChat分析显示，NMB阳性细胞与单核细胞之间通过TGM2–ADGRG1轴通讯增强，而NMB阴性细胞中SPP1-CD44和PPIA-BSG通路更活跃。NMB阳性细胞与T/NK细胞之间特异性检测到IFNG-(IFNGR1+IFNGR2)信号。免疫浸润分析显示，NMB表达与CD8⁺ T细胞、NK细胞、B细胞、巨噬细胞和树突状细胞等多种免疫细胞浸润呈负相关，与单核细胞浸润呈正相关，提示NMB与免疫荒漠型TME相关。

3.8 CMap筛选识别NMB相关ESCC的潜在治疗信号轴：CMap药物敏感性分析显示，ETB受体选择性拮抗剂IRL-2500具有最高的正向连接分数，多种PDE5抑制剂和血管扩张剂也呈正向连接。靶点富集分析提示候选化合物集中于内皮素-PDE5-cGMP信号轴、钙转运和血管调节通路。

3.9 NMB缺失抑制TE-1和KYSE30细胞的恶性表型：三个独立siRNA均显著降低NMB mRNA表达，其中si-NMB-1和si-NMB-2效率最高。NMB敲低显著抑制TE-1和KYSE30细胞的增殖、集落形成和迁移能力。

讨论与结论：讨论部分指出，NMB通过驱动线粒体氧化磷酸化和抗氧化解毒代谢程序，可能赋予肿瘤细胞在转移定植中的选择性生存优势。基因组分析支持氧化应激诱导基因组不稳定，NMB高表达肿瘤中NFE2L2激活突变可能通过持续激活NRF2上调AKR1C1，但这仍需实验验证。免疫微环境方面，NMB表达与CD8⁺ T和NK细胞浸润负相关，与单核细胞正相关；TGM2–ADGRG1轴可能促进单核细胞招募和M2样极化，IFNG信号可能诱导适应性免疫抵抗。CMap筛选提示内皮素-PDE5-cGMP轴可作为治疗靶点。局限性包括：分析仅基于肺转移样本，NMB调控线粒体呼吸链或AKR1C1转录的直接机制未知，CMap预测化合物未经动物模型验证。研究结论为：NMB是ESCC转移适应的关键驱动因子，通过基因组进化和免疫重塑赋予肿瘤细胞在转移定植中的生存优势，代谢适应是基因组改变的下游后果。