《Frontiers in Plant Science》：A γ-polyglutamic acid-based artificial biofilm for field delivery of Bacillus amyloliquefaciens KNU-28: an uncontrolled multi-orchard demonstration on peach gummosis with exploratory bark fungal community profiling
编辑推荐：
桃树流胶病主要由葡萄座腔菌复合种（Botryosphaeria dothidea sensu lato）引起，是一种破坏性溃疡病，目前缺乏环境友好的防控措施。本文报道了一项非受控的干预前后田间示范研究，采用基于γ-聚谷氨酸（γ-polyglutamic aci
桃树流胶病主要由葡萄座腔菌复合种（Botryosphaeria dothidea sensu lato）引起，是一种破坏性溃疡病，目前缺乏环境友好的防控措施。本文报道了一项非受控的干预前后田间示范研究，采用基于γ-聚谷氨酸（γ-polyglutamic acid, γ-PGA）的人工生物膜——一种可生物降解的递送平台，其载体非特异性设计此前尚未经过验证——包裹解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）KNU-28，在韩国18个商业桃园的143棵树上进行了应用。病情严重度从处理前4月基线的平均值4.12下降至8月的2.32（143棵树中76.2%改善≥1分），并在三个地区至10月进一步降至1.78（128棵树中88.3%）。在序次累积连接混合模型中，每次后续访视的严重度均低于4月基线；平均月比值比为0.70（95% CI 0.66–0.75）；其他模型设定结果一致。基于图像的ΔE量化（操作者独立）对74棵树进行了分析，显示队列水平一致的下降（病斑面积下降19–30%；经FDR校正后仅一个地区显著），但与序次评分在单株水平的一致性较弱（Spearman ρ = 0.16），因此该图像方法为补充性而非验证性。研究人员对23份树皮样本进行了真菌ITS2测序。树皮各组间多元离散度存在显著差异（PERMDISP F = 20.7, p < 0.001），而在考虑成分结构的度量下（Aitchison/稳健CLR，p > 0.34），健康与流胶病树皮并未分离；因此，名义上显著的Bray–Curtis PERMANOVA结果（R2 = 0.248, p = 0.001）不能被解读为质心差异。早期与后期处理患病群落之间无显著差异（p = 0.542；所有属FDR q > 0.5）。与健康树皮相比，流胶病树皮中Wickerhamomyces、Cytospora和Botryosphaeria（优势ASV归属于B. qingyuanensis）的相对丰度较高，但均未通过FDR校正。由于19个患病样本文库仅来自10棵树，属–严重度相关性分析被配对分析取代，该分析中没有任何属达到名义显著。综上，本示范确立了田间规模应用的可行性和一种参数透明的病斑量化方法；严重度下降和真菌群趋势为伴随性观察。由于缺乏未处理对照、菌株水平KNU-28追踪、树皮递送验证以及有足够效能的微生物组队列，数据不能确定因果疗效，需进行随机、未处理对照试验。
**论文解读：γ-PGA人工生物膜递送解淀粉芽孢杆菌KNU-28防控桃树流胶病的田间示范与树皮真菌群落探索**
**研究背景与问题**
桃树流胶病（peach gummosis）是核果类果园最具经济危害性的病害之一，主要病原为葡萄座腔菌复合种（Botryosphaeria dothidea sensu lato），其侵染树皮组织导致典型流胶、多年生溃疡和枝梢枯死，严重时数季内致树死亡，造成重大产量和经济损失。病原在树皮和木质部内定殖，并可呈潜伏内生状态，常规杀菌剂喷施和修剪仅能实现部分且短暂的防控效果。当前管理依赖合成杀菌剂（如戊唑醇、丙环唑）和清园措施，但公众对农药残留、土壤污染及抗药性病原种群的出现日益关注，亟需生物防治替代方案。解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）是研究最广泛的生防菌之一，其产生的伊枯草菌素、丰原素、杆菌霉素和表面活性素等脂肽类抗真菌代谢物可抑制多种植物病原菌。菌株KNU-28分离自韩国桃树叶片，前期研究显示其对葡萄座腔菌参考菌株KACC45481具有强拮抗活性，被列为流胶病候选生防菌。然而，常规生防制剂在田间植物表面持久性差，保护时效短。包埋技术可延长细胞存活并维持与靶标表面的紧密接触，但现有包埋系统几乎专门针对种子、根系或土壤递送，适用于木本树皮表面黏附与持留的载体研究相对缺乏。本研究开发了一种类似“Ooho”的人工生物膜，将KNU-28包埋于由γ-聚谷氨酸（γ-PGA）、海藻酸钠、透明质酸、碳酸钙、乙酸钠和支链淀粉组成的可降解基质中，旨在实现树皮表面黏附、持续释放生防菌且环境无残留。该制剂已申请专利。目前尚无研究在田间规模跨多个商业果园应用γ-PGA生物膜包埋的芽孢杆菌生防菌，并在处理季节同步分析树皮真菌群落。为此，研究团队在韩国四个行政区的18个商业桃园开展多点处理，结合月度病情监测和树皮ITS2扩增子测序，旨在（i）表征人工生物膜KNU-28处理下桃树流胶病的田间响应，（ii）描述流胶病树皮真菌群落相对于健康树皮的田间特征，并探索早期与后期处理的群落变化趋势，（iii）报告一种操作者独立、参数透明的图像化病斑面积测量方法及其与田间严重度评分的一致性。本研究设计为非受控、多果园干预前后示范试验，无并行未处理对照树，旨在为后续随机对照疗效验证提供田间规模假设。
**主要关键技术方法**
研究使用γ-PGA/海藻酸钠复合基质制备Ooho样人工生物膜，将KNU-28细胞包埋其中，通过手持压缩空气喷雾器直接喷施于流胶病树皮伤口表面，剂量约为5×10? CFU/cm2（为数量级上限估计）。病情评估采用1–5级序次量表，由两名训练有素的评估者每月进行，并采用序次累积连接混合模型（CLMM）进行统计分析。微生物组分析对23份树皮样本的ITS2区域进行Illumina MiSeq单端测序，经QIIME 2/DADA2流程降噪并推断ASV，使用UNITE数据库进行分类注释，并计算α多样性（Shannon、observed ASVs、Chao1、Simpson、Pielou）、β多样性（Bray–Curtis、Aitchison距离、稳健CLR）及PERMANOVA/PERMDISP检验。图像分析采用基于边框参考的ΔE方法，对74棵树的518张照片进行病斑像素分割和活跃/愈合分类。样本队列来源为韩国四地区18个商业桃园的143棵‘Hwangdo’品种桃树，其中23份树皮样本取自11个果园亚组。
**研究结果**
**3.1 田间对人工生物膜处理的响应**
在四个地区共143棵树上应用γ-PGA人工生物膜后，4月基线平均严重度为4.12，8月降至2.32（配对Wilcoxon p = 1.5×10?1?，秩双列相关r = 0.86），76.2%的树改善≥1分。CLMM模型显示所有后续访视严重度均低于4月基线（所有对比p < 0.001），线性月项模型给出每月比值比0.70（95% CI 0.66–0.75）。10月三个地区（n = 128）平均严重度降至1.78，88.3%的树改善（p = 1.0×10?1?）。图像分析显示队列水平病斑面积下降19–30%，但单株水平与序次评分相关性弱（ρ = 0.16）。
**3.2 真菌α多样性**
23个文库经7,800 reads抽平后，共恢复238个ASV。May组Shannon指数（1.594 ± 0.476）与July组（1.663 ± 0.312）无显著差异（p > 0.999）；observed ASVs、Chao1、Simpson和Pielou均匀度在组间也均无显著差异。所有15个比较经Benjamini–Hochberg校正后均不显著（最小q = 0.27）。配对Wilcoxon检验（9对匹配树）同样不显著。
**3.3 β多样性与群落结构**
Bray–Curtis距离PCoA显示三组表观聚类，但PERMDISP检测到显著的多元离散度异质性（F = 20.7, p < 0.001），健康组离散度远低于患病组。在成分感知距离（Aitchison、稳健CLR及不同流行度过滤子集）下，健康与患病对比均不显著（R2 = 0.049–0.089，p = 0.345–0.921）。ASV水平Bray–Curtis PERMANOVA虽给出名义显著分离（三组R2 = 0.168, p = 0.030；健康vs May R2 = 0.248, p = 0.001），但由于离散度异质性，不能被解读为群落组成差异。May与July之间无显著差异（R2 = 0.046, p = 0.542）。
**3.4 属水平真菌群落组成**
患病树皮中Botryosphaeriaceae、Cytosporaceae和Phaffomycetaceae相对丰度高于健康对照。May组患病树皮以Wickerhamomyces（9.64%）、Cytospora（9.36%）、Botryosphaeria（9.24%）和Nakazawaea（4.53%）共优势。优势Botryosphaeria ASV被UNITE分类为B. qingyuanensis而非B. dothidea。所有属水平May vs July差异经FDR校正后均不显著（所有q > 0.5）。配对重分析（9棵匹配树）中无任何属达到名义显著（最小原始p = 0.098，所有q = 1.00）。
**3.5 定制log-ratio效应量筛选**
健康vs May对比中，Wickerhamomyces（效应量?3.18）、Botryosphaeria（?3.16）和Nakazawaea（?2.85）效应最大，但均未通过FDR校正（最小q = 0.524）。May vs July对比中，6个属超过阈值（Naganishia、Kwoniella、Magnibotryascoma、Aureobasidium、Pleosporales属不确定、Calosphaeria），但均无显著差异。该筛选因存在伪重复，仅作为探索性排序，不提供方向性解释。
**3.6 疾病严重度与真菌属的相关性**
鉴于患病文库中严重度范围狭窄（May 1–3，July 1）且9/10的树被重复采样，原始相关性分析被撤回，改为配对检验。配对分析中无任何属在两个时间点间存在名义显著差异（最小原始p = 0.098）。
**3.7 树围与严重度变化**
树围与4月基线严重度无相关（ρ = ?0.032, p = 0.72），与10月严重度弱负相关（ρ = ?0.194, 原始p = 0.028），与Δseverity无显著关联（ρ = 0.140, p = 0.11）。经FDR校正后均不显著（q = 0.72, 0.085, 0.17），不支持树尺寸对严重度变化的影响。
**讨论与结论总结**
讨论部分强调，本非受控试验中严重度下降与季节自然动态、常规果园管理、回归均值及评估者期望效应难以区分，不能确立因果疗效。γ-PGA生物膜的平台通用性设计（载体非特异性）使其有望成为其他芽孢杆菌或PGPR菌剂的递送系统，但缺乏载体-only对照，需后续验证。微生物组分析中，健康与患病树皮的Bray–Curtis分离主要由离散度异质性驱动，成分感知距离下无显著差异，因此不能解读为群落组成变化；早期与后期处理群落也无差异。研究列出了多项局限性，包括无未处理对照、KNU-28定殖未定量、微生物组样本量小、健康对照不匹配、属水平结果均未通过多重检验校正、评估者兼任利益相关方等。结论部分指出，γ-PGA人工生物膜包裹KNU-28在韩国四个地区商业桃园的应用伴随桃树流胶病严重度的季节性下降（8月76.2%改善、10月88.3%改善），但该研究为非受控示范，观察到的下降和真菌群趋势应视为处理相关而非因果疗效估计，需进行随机、盲法、匹配未处理对照的田间试验，并开展菌株水平定殖追踪，才能支持正式功效或登记声明。此外，图像ΔE工作流提供了一种参数透明的病斑面积量化方法，但其与临床评分的单株一致性弱且活跃/愈合分层未经验证，仅作为补充手段。
