《Frontiers in Cell and Developmental Biology》：Transient histone deacetylase inhibition reveals cell type invariant and specific effects of chromatin decondensation on irradiation response
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放射治疗在乳腺癌治疗中发挥重要作用，但高剂量辐射同时损伤健康细胞和癌细胞。因此，需要进一步研究能够优先增敏癌细胞、同时不损伤周围健康组织且不产生有害副作用的联合疗法。组蛋白去乙酰化酶抑制剂药物(HDACis)已在基础研究和临床试验中作为放射增敏剂进行测试，但这
放射治疗在乳腺癌治疗中发挥重要作用，但高剂量辐射同时损伤健康细胞和癌细胞。因此，需要进一步研究能够优先增敏癌细胞、同时不损伤周围健康组织且不产生有害副作用的联合疗法。组蛋白去乙酰化酶抑制剂药物(HDACis)已在基础研究和临床试验中作为放射增敏剂进行测试，但这些治疗通常采用的长时间暴露以及缺乏匹配的健康细胞对照，常使其作用机制的部分方面尚不明确。在此，研究人员表明，对癌性和非致瘤性乳腺上皮细胞系进行瞬时(2小时)曲古抑菌素A(TSA)处理可增加即时DNA损伤，并在高辐射剂量下降低两种细胞类型的长期细胞活力。瞬时TSA处理还可增加其他癌细胞和健康细胞类型——A375黑色素瘤细胞和BJ5-ta成纤维细胞——在5 Gy X射线照射后的DNA损伤信号。这表明染色质解凝缩以细胞类型非依赖的方式增强细胞对高剂量辐射初始DNA损伤的易感性，且不依赖于较长TSA处理引起的DNA修复途径变化。然而，对较低辐射剂量和长期存活率的反应更具细胞类型特异性：仅MCF7细胞在1 Gy X射线照射后表现出TSA对DNA损伤的影响，而MCF10a细胞在TSA与辐射联合处理长期后表现出较明显的细胞活力效应。
**研究背景与现存问题**
放射治疗是乳腺癌的重要治疗手段，但高能射线在杀伤癌细胞的同时也会损伤健康组织的DNA。既往研究表明，染色质压缩状态可显著影响辐射诱导的DNA损伤水平：与DNA结合的组蛋白能吸收辐射能量从而保护DNA免受损伤，解凝缩的细胞核在高剂量辐照后较凝缩细胞核呈现更多DNA损伤信号。组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histone deacetylase inhibitor, HDACi)可增加组蛋白乙酰化、促使染色质解凝缩，已在基础研究与临床试验中作为放射增敏剂被广泛测试。然而，既往研究多采用12–96小时的长时间曲古抑菌素A(trichostatin A, TSA)处理，该处理本身即引起明显细胞毒性、增殖抑制及细胞周期阻滞等次级效应，难以评估染色质解凝缩这一单一因素对放射敏感性的贡献；同时多数研究缺乏匹配的健康细胞对照，无法明确增敏效应是否具有癌细胞特异性。为此，研究人员提出假设：通过2小时瞬时TSA处理增加染色质可及性可增强细胞对辐射的敏感性，并在癌细胞与正常细胞配对体系中加以验证。
**研究内容与主要方法**
研究人员选用ATCC(American Type Culture Collection)来源的非致瘤性乳腺上皮细胞MCF-10A、人乳腺癌细胞MCF-7作为主要配对模型，并以A375黑色素瘤细胞和BJ5-ta皮肤成纤维细胞作为另一配对验证体系。关键技术方法包括：MTS法检测细胞代谢活力；台盼蓝排斥实验检测细胞增殖活力；免疫荧光结合共聚焦显微镜定量H3K9ac及γ-H2AX信号；Western blot检测总组蛋白H3乙酰化水平；克隆形成实验评估辐射后长期存活能力；并利用公开转录组数据集(GSE59734、GSE96860、GSE275755、GSE252117)进行生物信息学分析。
**研究结果与结论**
(1)瞬时(2小时)TSA处理不影响健康与癌性乳腺上皮细胞的活力和增殖：MTS法与台盼蓝排斥实验均显示250–1000 nM TSA处理2小时对MCF-10A与MCF-7两种细胞均无显著毒性作用。
(2)瞬时TSA处理增加健康与癌性乳腺上皮细胞的组蛋白乙酰化：免疫荧光与Western blot显示H3K9ac及总H3乙酰化水平随TSA浓度升高而增加，其中MCF-7的乙酰化响应强于MCF-10A；公开RNA-seq数据显示MCF-7细胞本底组蛋白乙酰转移酶(histone acetyltransferase, HAT)表达水平较高而HDAC表达较低，可解释其更强的乙酰化响应。
(3)瞬时TSA处理增加多种细胞类型的X射线诱导DNA损伤信号：5 Gy照射前以500 nM TSA预处理2小时，MCF-10A、MCF-7、A375与BJ5-ta四种细胞系的γ-H2AX信号均显著增加；公开转录组数据显示短期TSA处理不改变Ku70、Ku86、DNA-PKcs等非同源末端连接(non-homologous end joining, NHEJ)修复基因的表达，提示该效应源于染色质状态改变而非DNA修复基因表达变化。
(4)短暂TSA处理的增敏效应在低辐射剂量下具有细胞类型特异性：1 Gy照射条件下，TSA预处理仅显著增加MCF-7细胞的γ-H2AX信号，MCF-10A与A375细胞无此效应；A375细胞在2 Gy剂量下亦无显著增敏。
(5)瞬时TSA处理改变健康与癌细胞辐射后的长期存活：TSA预处理不影响γ-H2AX信号随时间的消退速率，提示DNA修复速率未受抑制；克隆形成实验显示TSA预处理降低MCF-10A与MCF-7细胞经1、2、5 Gy照射后的集落形成能力，增敏比(sensitizer enhancement ratio, SER)为1.24–3.21，处于既往18小时长时间TSA处理报道范围的低端。
该研究发表于《Frontiers in Cell and Developmental Biology》。
**讨论与结论**
讨论部分指出，2小时TSA预处理在5 Gy高剂量下一致性地增加所有测试细胞类型的初始DNA损伤，支持染色质开放增强辐射损伤形成的普遍物理效应；而低剂量(1 Gy)下的细胞类型特异性可能源于MCF-7细胞较高的本底HAT/HDAC表达比值及其对TSA更强的乙酰化响应。研究人员强调，初始DNA损伤量并不简单转化为长期存活率，非致瘤性MCF-10A细胞在联合处理后长期存活亦显著下降，凸显了评估放射增敏治疗时纳入健康细胞对照的必要性。
研究结论为：初始组蛋白乙酰化状态与染色质解凝缩在TSA放射增敏机制中发挥重要作用，在高剂量辐射下可普遍增加各细胞类型的DNA损伤；低剂量辐射下不同细胞类型的差异性响应值得进一步探索。鉴于临床治疗性辐射剂量多处于1–2 Gy范围，理解该剂量范围内放射增敏剂的差异化反应具有重要意义；2小时TSA处理即可产生增敏效应，提示通过优化HDACi治疗时序或局部给药有望在不增加药物单独毒性的前提下最大化放射增敏效果。
