《Frontiers in Neuroscience》：Goreisan-mediated suppression of chemokine and cytokine production in astrocytes under AQP4-expressing conditions
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摘要
目的：水通道蛋白-4（AQP4）主要表达于星形胶质细胞，已有研究提示其通过放大细胞因子和趋化因子的产生参与神经炎症。Goreisan（GRS）是一种日本传统汉方药，可调节AQP4相关的水稳态。然而，其对AQP4相关炎症过程的作用尚不明确。本研究旨在阐明G
摘要
目的：水通道蛋白-4（AQP4）主要表达于星形胶质细胞，已有研究提示其通过放大细胞因子和趋化因子的产生参与神经炎症。Goreisan（GRS）是一种日本传统汉方药，可调节AQP4相关的水稳态。然而，其对AQP4相关炎症过程的作用尚不明确。本研究旨在阐明GRS的抗炎作用，特别关注在AQP4表达条件下观察到的炎症反应。
方法：采用原代培养星形胶质细胞和AQP4过表达的NIH-3T3成纤维细胞进行体外实验，以脂多糖（LPS）或肿瘤坏死因子-α（TNF-α）刺激，并给予或不给予GRS处理。通过定量逆转录聚合酶链反应评估细胞因子和趋化因子的表达水平，通过蛋白质印迹法评估ERK磷酸化。采用LPS诱导的神经炎症小鼠模型评估口服GRS对炎症标志物和胶质细胞活化的影响。同时检测了各生药组分的贡献。
结果：GRS抑制了LPS和TNF-α诱导的原代星形胶质细胞及AQP4表达NIH-3T3细胞中细胞因子和趋化因子mRNA的表达。在体内，GRS给药降低了脑内炎症细胞因子的表达并减弱了胶质细胞活化。在AQP4表达条件下，GRS减弱了ERK磷酸化，且与趋化因子mRNA表达的降低相平行。此外，GRS的组分之一桂皮（Cinnamomi cortex）被鉴定为这些抗炎作用的主要贡献者。
结论：这些研究结果表明，GRS对炎症基因表达和ERK激活的作用与AQP4表达条件相关。然而，本数据并未确立AQP4是GRS的直接或主要分子靶点。因此，GRS可能提供一种调节AQP4表达条件下所观察到的炎症反应的潜在药理学方法，但仍需进一步研究以确认其治疗相关性。
论文解读：GRS在AQP4表达条件下抑制星形胶质细胞趋化因子与细胞因子产生的研究
**研究背景与目的**
水通道蛋白-4（AQP4）是中枢神经系统中主要的水通道蛋白，富集于星形胶质细胞足突，面向脑微血管和胶质界膜。除经典的介导水跨膜转运功能外，越来越多的证据表明AQP4参与星形胶质细胞在神经炎症等病理状态下的反应。多种中枢神经系统疾病，如视神经脊髓炎谱系障碍、多发性硬化、创伤或缺血性脑损伤以及慢性神经退行性疾病中，均观察到AQP4表达或定位的改变。星形胶质细胞是神经炎症反应的核心调节者，在炎症刺激下表达细胞因子和趋化因子，影响周围胶质细胞、神经元和血管成分。既往研究提示，AQP4表达与星形胶质细胞增强的炎症反应相关，而AQP4缺失或药理学阻断可在多种实验模型中减弱炎症信号。然而，能够调节AQP4相关炎症反应的药理学手段仍然有限。Goreisan（GRS）是一种日本传统汉方药，长期用于水肿、头晕和头痛等与体液失衡相关的症状。实验研究包括研究团队前期工作已表明，GRS可调节AQP4相关的水转运并减轻体内脑水肿。这提示GRS可能也影响与AQP4表达相关的炎症反应。然而，GRS是否影响星形胶质细胞炎症信号及其如何与AQP4表达相关联尚未明确。为此，本研究旨在利用体外和体内模型研究GRS对炎症基因表达的影响，特别关注AQP4表达条件下观察到的反应，并进一步探讨ERK磷酸化及各生药组分（包括桂皮）的贡献。
**主要技术方法**
研究人员采用原代培养的大鼠星形胶质细胞以及AQP4过表达的NIH-3T3成纤维细胞作为体外模型。NIH-3T3细胞因内源性AQP4表达极低，可在相同细胞背景下比较空载体转染与AQP4表达细胞的差异，故用作异源AQP4表达系统。以脂多糖（LPS）或肿瘤坏死因子-α（TNF-α）刺激细胞，并用定量逆转录聚合酶链反应（RT-qPCR）检测细胞因子和趋化因子mRNA表达，用蛋白质印迹法评估ERK磷酸化。体内实验采用C57BL/6J小鼠，通过脑室内注射LPS诱导急性神经炎症模型，口服给予GRS（3 g/kg），随后检测脑组织炎症标志物mRNA表达、胶质细胞活化标志物（Iba-1和GFAP）免疫荧光染色以及AQP4表达。此外，还分别检测了GRS五种生药组分及桂皮主要化学成分（肉桂醛和肉桂酸）的作用。
**研究结果**
**1. GRS抑制原代星形胶质细胞中趋化因子和细胞因子表达**
在LPS刺激的原代培养星形胶质细胞中，GRS以剂量依赖性方式（0.01–0.1 mg/mL）抑制CCL2、IL-1β和IL-6 mRNA表达，其抑制作用与地塞米松（DEX）相当。AQP4特异性抑制剂TGN-020也抑制这些细胞因子的表达。此外，LPS刺激增加AQP4 mRNA水平，而GRS和TGN-020可显著抑制该上调，但DEX无此作用。这提示GRS和TGN-020的作用机制可能与一般抗炎药物不同。
**2. AQP4过表达增强趋化因子表达，且GRS抑制该增强反应**
在AQP4过表达的NIH-3T3细胞中，TNF-α或LPS刺激后角质形成细胞趋化因子（KC）mRNA表达较空载体（EV）转染的对照细胞显著增强。GRS剂量依赖性地降低AQP4表达细胞中LPS诱导的KC表达，但对EV转染细胞无影响。该作用与TGN-020和DEX相当，表明GRS可减弱在AQP4表达条件下观察到的增强炎症反应。
**3. GRS抑制AQP4表达条件下的趋化因子mRNA表达并伴随ERK磷酸化减弱**
在AQP4过表达的NIH-3T3细胞中，LPS刺激诱导ERK磷酸化，而GRS、TGN-020以及MEK抑制剂U0126均抑制该磷酸化。同时这些处理也降低KC mRNA表达，提示在AQP4表达条件下，ERK激活与趋化因子mRNA表达相关联。
**4. 桂皮及其成分对GRS抗炎作用的贡献**
在AQP4过表达细胞中，GRS的组成生药中只有桂皮（Cinnamomi cortex）能显著降低TNF-α诱导的KC mRNA水平并抑制ERK磷酸化，表明桂皮是GRS抗炎作用的主要贡献者。进一步研究桂皮的主要化学成分发现，肉桂醛（cinnamaldehyde）和肉桂酸（trans-cinnamic acid）均能抑制AQP4表达细胞中KC mRNA表达，且不影响EV转染细胞，同时也抑制LPS诱导的ERK磷酸化。这表明GRS的抗炎作用至少部分归因于肉桂醛和肉桂酸。
**5. GRS在体内抑制LPS诱导的脑内炎症**
在LPS脑室内注射的小鼠模型中，LPS显著上调脑内IL-1β和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）mRNA表达，而口服GRS（3 g/kg）可明显降低这些炎症标志物的表达。免疫荧光染色显示，LPS增加Iba-1和GFAP免疫反应性，GRS处理减弱了这些变化，表明GRS抑制了胶质细胞活化。GRS还抑制了AQP4的表达。此外，当从配方中删除桂皮后，GRS的抗炎作用减弱，进一步强调了桂皮的关键作用。
**讨论与结论**
本研究证实GRS在体外和体内均能抑制LPS诱导的炎症反应。AQP4表达细胞较EV转染细胞表现出更强的炎症刺激诱导的KC mRNA表达，而GRS在AQP4表达条件下减弱这些反应，支持AQP4表达状态与炎症基因表达幅度之间存在关联，但仍局限于当前实验设计的范围内。神经炎症是星形胶质细胞和小胶质细胞之间复杂相互作用的高度协调过程。星形胶质细胞来源的介质（如CCL2）参与小胶质细胞活化和神经炎症信号的持续，而小胶质细胞来源的IL-1α、TNF和C1q可通过C3/C3aR/NF-κB通路促进神经毒性A1星形胶质细胞转化。AQP4已显示通过激活NF-κB和MAPK等胞内通路参与星形胶质细胞细胞因子分泌、炎症放大和胶质细胞相互作用。GRS的抗炎作用在AQP4表达条件下更为明显，这得到TGN-020类似作用的支持；而DEX在EV和AQP4转染细胞中均抑制炎症反应，提示GRS响应的炎症信号与一般抗炎药物所影响的途径不同。在机制方面，AQP4表达与更强的炎症刺激诱导的ERK激活相关，U0126减弱AQP4表达细胞中KC mRNA的增加，桂皮、肉桂醛、肉桂酸和GRS在AQP4表达条件下抑制ERK磷酸化，与KC mRNA变化一致。关于LPS和TNF-α的用途，脑室内LPS用于诱导急性广泛的神经炎症反应，以评估口服GRS在整体脑环境中的效果；而TNF-α在筛选实验中用作明确的炎症刺激，以比较各生药和化学成分的作用。尽管两者通过不同受体启动信号，但其下游炎症通路部分重叠，包括MAPK/ERK和NF-κB信号，因此TNF-α刺激系统适合鉴定GRS中贡献的成分。药代动力学研究表明，桂皮来源的肉桂酸及相关化合物可穿透进入脑内，因此GRS的部分成分可能到达中枢神经系统并发择药理作用。此外，AQP4是类淋巴系统的核心组成部分，介导炎症因子、代谢废物和淀粉样蛋白-β的清除，因此涉及AQP4的治疗策略需考虑其在维持脑脊液-组织间液交换和支持病理条件下炎症放大中的双重作用。本研究存在一些局限性：未定量评估细胞活力和细胞毒性，因此不能排除轻微细胞毒性对炎症基因表达降低的贡献；细胞因子和趋化因子主要是在mRNA水平评估，未确定相应蛋白质产生或释放的变化；数据也未确立AQP4是GRS的直接或主要分子靶点，AQP4非依赖机制可能参与其作用。总之，这些发现表明GRS可减弱炎症基因表达和胶质细胞活化，其机制可能涉及AQP4相关的ERK信号以及抑制炎症相关AQP4上调。虽然需要进一步研究以明确AQP4功能性抑制的直接贡献，并在蛋白质水平确认细胞因子和趋化因子的释放，但调节AQP4相关炎症反应可能部分解释GRS的药理作用。该研究为未来探讨GRS在涉及AQP4和胶质细胞活化的神经炎症疾病（如视神经脊髓炎谱系障碍、多发性硬化、阿尔茨海默病和头痛）中的潜在应用价值提供了基础。
（论文发表于《Frontiers in Neuroscience》）
