《Frontiers in Aging Neuroscience》：A validated workflow for paired total and small RNA sequencing from low-input submandibular gland biopsy specimens in de novo Parkinson’s disease patients
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帕金森病（Parkinson’s disease, PD）以进行性α-突触核蛋白（α-synuclein）聚集为特征，但驱动该过程的分子机制尚未完全阐明。转录组学分析可为PD发病的RNA介导调控提供重要见解，但受累脑组织的可及性低及尸检RNA降解限制了相关研究
帕金森病（Parkinson’s disease, PD）以进行性α-突触核蛋白（α-synuclein）聚集为特征，但驱动该过程的分子机制尚未完全阐明。转录组学分析可为PD发病的RNA介导调控提供重要见解，但受累脑组织的可及性低及尸检RNA降解限制了相关研究。下颌下腺（submandibular gland, SMG）表现出与黑质相当的α-突触核蛋白病理，是临床可获取的外周组织，但超声引导穿刺芯活检仅获少量组织，使全面RNA测序技术难度高。研究人员提出并验证了一套工作流程，用于从PD初发（de novo）患者及年龄匹配、无神经疾病手术对照的低输入SMG活检标本中进行配对总RNA与小RNA测序。超声引导芯针活检获约1.2×7–10 mm标本，同日晨采集空腹外周血以供组织-血液直接比较。经即时组织稳定化、RNA提取、文库制备与下一代测序后，从RNA完整性、文库质量、测序指标、比对表现与重复性评估流程性能。尽管组织输入有限，该方案持续生成适用于总RNA测序与小RNA测序的高质RNA，建立可重复文库，实现蛋白质编码转录本及miRNA、piRNA、snoRNA、snRNA、tRNA衍生RNA等多类小非编码RNA的全面谱定。该验证流程为微创SMG活检标本及配对空腹外周血的综合转录组学谱定提供了实用可重复方法，可推动PD疾病机制、生物标志物发现与转化应用研究。
研究背景方面，帕金森病以错误折叠α-突触核蛋白聚集驱动神经退变为核心，缺乏疾病修饰疗法，其从单体到聚集态转化的分子机制未明。RNA代谢与转录后调控日益被认为参与α-突触核蛋白生物学，但既往PD转录组研究依赖尸检脑组织，死后间隔导致RNA降解，难以捕捉早期变化。外周组织中SMG因自主神经丰富且α-突触核蛋白病理与黑质相当，成为活体采样理想替代；然而超声引导芯针活检取材仅约1.2×7–10 mm，低输入量下同时完成总RNA与小RNA高质量配对测序尚无标准流程。研究人员由此开展方法学验证，旨在建立从低输入SMG活检及配对空腹外周血进行双模RNA测序的可重复工作流，并为后续机制与标志物研究提供基础设施。
主要关键技术方法包括：队列来自韩国首尔圣玛丽医院7例药物未治PD初发患者与6例年龄性别匹配、经神经检查排除神经精神疾病的头颈癌SMG切除对照；PD组于18F-FP-CIT多巴胺转运体PET/CT提示摄取降低侧行超声引导18 G芯针活检，标本离体<1分钟入RNAlater，对照切除标本1–20分钟稳定化；同晨采空腹静脉血入PAXgene管。SMG组织用QIAzol/TRIzol法提取RNA，全血用PAXgene Blood RNA Kit；总RNA测序取0.5 μg用TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Gold（血液加Globin depletion）建库，NovaSeq 6000双端2×101 bp；小RNA测序取3 μg用TruSeq Small RNA Library Prep Kit建库，单端51 bp；生物信息学上总RNA用Trimmomatic-HISAT2-StringTie-DESeq2，小RNA用Cutadapt过滤后比对miRBase 22.1与RNAcentral 14.0，edgeR做差异分析。
研究结果部分，参与者入组小节报告13人入组（7 PD、6对照），PD组均de novo、药物未治，年龄64.1±6.2岁，Hoehn-Yahr 1–3，UPDRS-III 3–52。样本RNA质量控制小节显示除1份周五采血、周末4℃存放血液RINe为4.9外，其余RINe≥6（均值7.88），SMG虽小但产量足建双库，电泳见清晰18S/28S峰。cDNA文库质量控制小节中总RNA文库峰300–400 bp，小RNA文库峰140–150 bp。测序后质控小节报告总RNA Q30 94.88–96.63%，比对率>97%，SMG样本PCA前两主成分解释21.5%+12.9%，血液39.6%+23.6%，组内Pearson相关SMG 0.99–1.00、血液0.93–1.00；小RNA原始读长Phred高，修剪后21–23 nt峰对应成熟miRNA，24–30 nt次峰含piRNA，<17 nt极少。
讨论总结指出，该研究首次系统验证低输入SMG穿刺标本并联配对空腹血的“总RNA+小RNA”双测序流程，克服尸脑降解与活体脑不可采样限制；SMG在PD中α-突触核蛋白负荷已知，本流程证明微创活检亦可产出满足DESeq2与edgeR分析的RNA资源。结论翻译如下：该验证工作流程为低输入SMG活检标本与配对空腹外周血的综合转录组学谱定提供了实用且可重复的方法，有望促进帕金森病中疾病机制、生物标志物发现及转化应用未来研究。论文发表于《Frontiers in Aging Neuroscience》。
