可同化多种烃类和芳香族化合物的高粘附细菌Acinetobacter sp. Tol 5的碳代谢表征

《Frontiers in Microbiology》：Characterization of carbon metabolism in a highly adhesive bacterium Acinetobacter sp. Tol 5 capable of assimilating diverse hydrocarbons and aromatic compounds

　　

可持续生物生产需要开发具有广泛代谢多功能性和适合工业应用的稳健微生物底盘。Acinetobacter sp. Tol 5是一种高粘附细菌，能够利用多种烃类，使其成为固定化全细胞催化的有前景的底盘候选菌株。在本研究中，研究人员通过从基因组数据重建代谢途径图谱，并分析在以乙醇、十六烷、甲苯和苯酚为碳源生长的细胞的转录组，表征了Tol 5的碳代谢。基因组分析显示，Tol 5对糖的利用能力有限，但拥有多种烷烃和芳香族化合物的代谢途径，包括五条不同的芳香族降解途径，扩展了Acinetobacter属已知的代谢多样性。转录组分析确定了响应每种碳源而诱导的特异性途径基因。在苯酚生长期间，烷基苯降解基因与苯酚单加氧酶基因一起上调，表明芳香族降解途径之间可能存在底物依赖性交叉调控。基因破坏实验表明，苯酚单加氧酶是苯酚同化所必需的，而甲苯双加氧酶可能有助于更早进入指数生长期，但可能限制最终生物量积累。这些发现提供了Tol 5碳代谢的全面视图，并为其在利用非糖碳源的生物过程中的潜力评估提供了基础。

可持续生物生产需要构建兼具广泛底物谱和工业适应性的微生物底盘。典型模式菌株如大肠杆菌（Escherichia coli）虽遗传操作成熟，但天然可利用的底物仅限于糖类和有机酸，且对芳香烃等有毒底物耐受性差，难以用于非糖碳源的生物转化。环境微生物如恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）因具有高溶剂耐受性和多样分解代谢途径而被广泛研究，但新的底盘菌株仍需持续挖掘。不动杆菌属（Acinetobacter）广泛分布于土壤、水体及污泥中，其基因组可塑性强、环境胁迫耐受性高，其中Acinetobacter sp. Tol 5是从废气处理反应器中分离的革兰氏阴性菌，具有与大肠杆菌相当的生长速率，能够利用苯、甲苯、二甲苯等芳香烃以及羧酸、醇、单萜和甘油三酯等多种非糖碳源。此外，Tol 5通过细胞表面纤维蛋白AtaA表现出极强的粘附性和自凝集能力，可实现可逆的细胞固定化，利于固定化全细胞催化。然而，其代谢网络此前尚未被系统解析，限制了该菌株的理性工程改造。为此，研究人员基于Tol 5的完整基因组序列重建代谢途径，并结合不同碳源培养下的转录组分析及基因破坏实验，全面表征了其碳代谢特征。

研究人员首先从NCBI数据库获取Tol 5的完整基因组（染色体和质粒，登录号AP024708和AP024709），利用BLASTP、BlastKOALA、KAAS和eggNOG-mapper等工具进行功能注释，并通过KEGG mapper重建中心碳代谢途径；操纵子结构使用Operon-mapper和Rockhopper预测。随后，研究人员通过胞苷碱基编辑系统构建基因敲除突变株，测定Tol 5在多种碳源（包括糖类、正构烷烃C8–C32、醇和芳香族化合物）上的生长情况。为探究底物特异性转录响应，以乳酸为参考碳源，对分别以乙醇、十六烷、甲苯和苯酚为唯一碳源生长的细胞进行RNA测序（RNA-seq），利用fastp、Bowtie2、featureCounts和edgeR分析差异表达基因，并进行过表达分析（ORA）。所有生长实验均设多个生物学重复，转录组每个条件设三个生物学重复。

3.1 Tol 5中心碳代谢的基因组特征：基因组注释显示Tol 5具备糖异生、磷酸戊糖途径、三羧酸（TCA）循环、乙醛酸支路、β-氧化和脂肪酸合成等完整途径，但缺乏己糖激酶、磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶，导致糖酵解途径不完整，也缺少Entner–Doudoroff（ED）途径和戊糖利用基因。实验结果证实Tol 5不能利用D-葡萄糖、D-果糖、L-阿拉伯糖和葡萄糖酸钠。相反，它编码多种醇脱氢酶（ADH）和醛脱氢酶（ALDH），可通过三条乙酸同化途径利用醇和脂肪酸，并可合成蜡酯和聚羟基烷酸酯（PHA）。

3.2 Tol 5烷烃代谢的基因组特征：基因组中鉴定到膜结合烷烃单加氧酶AlkB、三个含黄素单加氧酶（AlmA、LadA_1、LadA_2）以及质粒编码的CYP153家族细胞色素P450单加氧酶。生长实验表明，Tol 5能以十二烷（C12）、十六烷（C16）、二十四烷（C24）和三十二烷（C32）为唯一碳源生长，但不能利用辛烷（C8），表明其可代谢至少C12及更长链的正构烷烃。

3.3 Tol 5芳香族化合物代谢的基因组特征：通过操纵子预测和途径重建，共鉴定出五条芳香族降解途径：原儿茶酸（PCA）途径、儿茶酚（CAT）途径、甲苯/烷基苯降解（TOD）途径、苯乙酸（PAA）途径和尿黑酸（HMG）途径。其中TOD途径在Acinetobacter属中罕见，与P. putida F1的相应基因高度同源。生长实验证实Tol 5能以苯甲酸、苯酚、乙苯、对羟基苯甲酸、香草酸、奎宁酸和莽草酸等为唯一碳源生长，但未能利用L-苯丙氨酸、尿黑酸等芳香族氨基酸相关底物。

3.4 以醇和烷烃为碳源细胞的转录组响应：以乳酸为参照，乙醇培养细胞仅14个基因上调，其中yiaY_1和aldB被诱导，推测分别编码乙醇氧化所需的ADH和ALDH。十七烷（原文为hexadecane，即十六烷）培养细胞有266个基因上调，其中烷烃羟化酶基因alkB和CYP153被特异性诱导，同时β-氧化途径的fadA、fadB、fadD4、fadE和ydiO_5等基因表达上调，表明十六烷通过末端氧化进入脂肪酸β-氧化途径代谢。

3.5 以芳香族碳源细胞的转录组响应：甲苯培养强烈诱导完整的tod操纵子，而mph和cat操纵子诱导水平很低，表明甲苯专一性地通过TOD途径降解。苯酚培养则同时诱导mph、cat以及tod操纵子。进一步基因破坏实验显示，破坏todC1（甲苯双加氧酶大亚基）或todE（儿茶酚2,3-双加氧酶）会完全消除Tol 5在甲苯上的生长，而破坏mphN（苯酚单加氧酶大亚基）对甲苯生长无影响；在苯酚培养中，mphN破坏导致完全不能生长，而todC1破坏则延长了延滞期但最终细胞产量更高，提示甲苯双加氧酶在苯酚同化中仅起辅助作用，且其活性可能降低碳向生物量的转化效率。

讨论指出，Tol 5的代谢网络兼具Acinetobacter和Pseudomonas的特征，其五条芳香族降解途径扩展了该属已知的代谢多样性。mph操纵子中额外存在catA基因的独特结构，以及ben操纵子中catA的分布，可能有助于协调儿茶酚代谢、避免有毒中间产物积累。tod基因很可能经水平基因转移获得，其在苯酚代谢中的作用模式与P. putida不同。转录组还显示，在芳香族碳源上生长时大量核糖体基因下调，并伴随压力响应和信号转导相关基因的变化，反映出细胞对膜损伤和活性氧胁迫的适应。这些发现为Tol 5作为非糖碳源生物过程底盘提供了系统依据，但其在混合底物和实际污染场景中的性能仍需进一步验证。总之，该研究全面揭示了Tol 5的碳代谢能力，丰富了Acinetobacter属的代谢多样性认知，并为利用烃类和芳香族污染物的生物修复及固定化生物催化奠定了理论基础。论文发表在《Frontiers in Microbiology》。