《Frontiers in Biophysics》：Benchmarking protein-ligand co-folding across Nav, Cav and Kv-family channels
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全原子蛋白质-配体共折叠提供了一种无需预设受体构象或结合位点即可建模生物分子复合物的途径，但其对大型、状态依赖性膜蛋白的可靠性仍不确定。在此，研究人员建立了一个训练截止日期感知的基准测试集（training-cut-off-aware benchmark），包
全原子蛋白质-配体共折叠提供了一种无需预设受体构象或结合位点即可建模生物分子复合物的途径，但其对大型、状态依赖性膜蛋白的可靠性仍不确定。在此，研究人员建立了一个训练截止日期感知的基准测试集（training-cut-off-aware benchmark），包含电压门控钠（Nav）、钙（Cav）和钾（Kv）通道的实验解析配体结合复合物，以评估AlphaFold 3、Boltz-2和Protenix-v2在多种配体表征下的表现。最终生产数据集包含301个完成的方法-输入任务和7,525个预测结构，这些结构由RCSB/CACTVS SMILES、蛋白质数据银行化学组分词典（Protein Data Bank Chemical Component Dictionary, CCD）标识符以及匹配的PubChem和ChEMBL表征生成。各方法的可执行覆盖率差异显著，尤其是在Kv家族系统中，因此需要将平衡的姿态精度比较限制在三种方法均完成的22个Nav和Cav复合物上。AlphaFold 3、Boltz-2和Protenix-v2的排名第一配体重原子均方根偏差（root-mean-square deviation, RMSD）中位数分别为19.85 ?、22.12 ?和20.25 ?。25选1（Best-of-25）选择改善了姿态精度，但仅在两个、三个和三个系统中分别恢复了与实验参考偏差在5 ?以内的配体姿态，表明采样不足是主要限制，排序错误仅对较小子集有贡献。尽管受体架构大体得以保持，所有方法的同口袋恢复率仍低于50%，且方法原生置信度指标对配体姿态精度的区分能力有限。替代配体表征产生了较小的总体变化，但对执行、姿态类别和排序产生了显著的系统特异性影响。近似紧密接触筛查在部分预测中发现了额外的几何问题。总体而言，这些结果表明当前的共折叠方法作为离子通道配体结合模式的独立预测器仍不可靠，并强调姿态采样、口袋选择、配体表征和独立结构验证应作为方法学发展的优先方向。
**研究背景与目的**
电压门控离子通道是膜兴奋性的核心决定因素，参与电信号传导、钙内流、分泌及肌肉收缩等众多生理过程；Nav、Cav和Kv通道的异常活动已成为神经、心血管、肌肉、炎症及精神疾病的重要治疗靶点。冷冻电镜（cryo-EM）高分辨率结构的不断涌现，揭示了配体结合于中央空腔、侧向窗孔、电压传感结构域及脂质暴露沟槽等多种别构位点的机制。然而，离子通道体积庞大、具有伪对称性或寡聚组装特征，且存在多个药理学上不同的口袋和显著的功能状态依赖性，使其成为蛋白质-配体复合物计算预测的严峻挑战。全原子共折叠方法（如AlphaFold 3、Boltz-2和Protenix-v2）可在不预设受体构象或结合位点的情况下联合生成蛋白质-配体复合物，但其对大型状态依赖性膜蛋白的可靠性尚不清楚。此前缺乏一个同时评估可执行覆盖率、姿态采样与排序、结合位点恢复、配体表征敏感性及几何合理性的离子通道专项基准测试。
**研究内容与结论**
研究人员建立了一个训练截止日期感知的基准测试集，包含实验解析的Nav、Cav和Kv家族通道配体结合复合物，对AlphaFold 3、Boltz-2和Protenix-v2在RCSB/CACTVS SMILES、PDB化学组分词典（CCD）标识符及匹配的PubChem和ChEMBL表征等多种配体输入条件下进行了系统评估。最终生产数据集包含301个完成的方法-输入任务、7,525个预测结构。结果表明，三种方法在严格共同子集（22个Nav和Cav复合物）中的配体姿态预测均不可靠：中位排名第一配体重原子均方根偏差（RMSD）为19.85 ?（AlphaFold 3）、22.12 ?（Boltz-2）和20.25 ?（Protenix-v2）；25选1（best-of-25）选择仅在2、3和3个系统中恢复5 ?以内的近实验姿态，表明采样不足是主要限制。该研究发表在《Frontiers in Biophysics》。
**关键技术方法**
研究从RCSB蛋白质数据银行（PDB）人工筛选近期发布的配体结合Nav、Cav和Kv结构，并按各方法训练截止日期（AlphaFold 3和Protenix-v2为2021年9月30日，Boltz-2为2023年6月1日）进行回顾性盲测过滤。每种方法-系统-表征任务使用5个随机种子、每种子5个样本生成25个预测结构；受体叠合后计算配体重原子RMSD、质心距离、口袋召回率/精度/Jaccard重叠及同口袋分类；采用US-align多聚体模式评估受体TM-score；以2.0 ?（蛋白质-配体）和1.0 ?（配体内）重原子接触阈值进行近似紧密接触筛查。统计方法包括配对Wilcoxon符号秩检验、Friedman检验及Benjamini-Hochberg校正。
**研究结果**
*训练截止日期感知的离子通道基准显示可执行覆盖率不均。* AlphaFold 3完成了主要SMILES面板全部44个系统，而Boltz-2和Protenix-v2仅完成23和25个；Kv家族系统差异最为显著（AlphaFold 3完成20/20，Boltz-2为0，Protenix-v2为3）。
*近实验配体姿态在共同子集中很少被采样。* 在22个共同系统中，排名第一的配体姿态普遍远离实验参考；最佳25选1的5 ?恢复率仅2-3个系统；排名间隙（ranking gap）中位数为2.24-3.88 ?，表明采样失败是主导因素，排序错误是次要因素。
*配体表征引入系统特异性不稳定性。* CCD与SMILES输入的中位RMSD差异仅为-0.24至-1.25 ?；PubChem/ChEMBL来源在聚合水平影响小，但可在单个系统中改变执行成功率、姿态类别或排名顺序。
*口袋恢复与置信度揭示RMSD之外的局限。* 同口袋恢复率在排名第一预测中为13.6%-27.3%，25选1后为31.8%-40.9%，均低于50%；方法原生置信度与配体RMSD的相关系数仅为-0.095至-0.407，区分能力有限。
*结合位点环境、受体架构与几何合理性界定不同失败模式。* 5 ?以内的成功恢复集中于Nav孔道/选择性过滤器相关位点；受体中位参考归一化TM-score为0.759-0.807，表明全局折叠大体保持但局部口袋选择失败；602个代表结构中154个存在异常短重原子接触。
**讨论与结论**
讨论指出，可执行覆盖率应视为基准性能的组成部分而非外围细节；采样失败是均衡Nav/Cav比较中的主要障碍。研究还发现，方法原生置信度不应视为可互换的校准概率，配体表征的敏感性提示需报告配体来源与立体化学规范。局限性包括共同子集较小且不含Kv系统、RMSD未做对称性校正、以及未评估基于受体的对接方法。总体结论是：当前共折叠方法尚不能作为离子通道配体结合模式的独立预测工具；受体全局折叠的保持并不能保证配体结合模式的准确性。该基准通过区分采样、排序、口袋选择、配体表征和几何合理性等多个失败轴，为评估未来方法学进步提供了基础框架。
