专家谈：如何应对单细胞实验数据分析中的挑战

单细胞实验往往会产生规模庞大且噪声明显的数据集。对研究人员而言，主要挑战在于保留源于生物学差异的方差，同时通过减少非生物学来源的方差。这一点对单细胞实验而言格外具有挑战性。

Bruker公司研发部门副总裁Eric Hobbs指出，即使是遗传上完全相同的细胞，其行为也可能大相径庭。风险在于将这种自然差异误认为是噪声，或者更糟的是，通过求平均值将其消除，从而完全丢失生物学信息。

在单细胞分析中，人们的目标是保留生物学差异中蕴含的信息。本文探讨了单细胞分析中时常遇到的挑战以及应对策略。

万事开头难

10x Genomics公司副总裁Peter Smibert指出，许多导致结果很难解释的现象，例如批次效应、噪声升高和信号丢失（dropout），往往可以追溯到实验设计和样本处理的上游环节。

因此，专业人士的建议是尽量缩短样本采集与处理之间的时间间隔，以减少因细胞降解或受损而产生的假象，这些假象可能会掩盖真实的生物学信号。

Parse Biosciences公司产品经理Vicky Morrison提示，在组织分离过程中既要迅速又要轻柔，并保持样本低温，这样能减少细胞应激和死亡。留意这些步骤，不仅能减少后期过滤的必要性，还能保留真实的生物学信号，从而获得更容易解读的数据集。

在无法快速处理样本时，应考虑对样本进行固定。“固定能保留细胞在采集时的生物学状态，有效锁定基因表达谱，并避免在操作过程中发生转录变化，” Morrison补充道。

还有一点值得关注，那就是在设计实验时将数据分析放在首位。即使不了解具体细节，研究人员至少要理解其分析方法的工作原理。Smibert建议，研究团队应根据实验问题和观察结果，有针对性地选择计算工具，包括与计算专家进行交流。

应对棘手的问题

在单细胞分析流程中，任何掩盖生物信号的因素都会带来问题，而且这种情况并不罕见，因为信号本身就非常微弱。不过，对于批次效应、背景噪声、信号丢失和双细胞（doublets）等问题，人们可以提前做好准备。

批次效应

批次效应很容易导致结果出现变化，从而掩盖真实的生物学信号。如果样本在不同时间由不同研究人员处理，批次效应很难避免。解决方案是尽量保持一致性，虽然这是老生常谈。

Vugene公司首席生物信息学家Vilija Lomeikaite表示：“标准化的样本制备流程，结合样本多重分析以及在不同测序运行中随机分配样本，有助于确保实验设计的平衡性并减少批次效应。”

在尝试避免批次效应后，您还可以在分析过程中使用批次校正，以消除在不同条件下处理的样本之间的差异。Lomeikaite指出： “使用Harmony等工具进行数据整合，可以在消除技术差异的同时保留生物学差异。”1

背景噪声

背景噪声可能有多种来源，可通过过滤来降低其影响。例如，在单细胞RNA测序（scRNA-seq）中，背景噪声可能源于破裂细胞和凋亡细胞释放的残留RNA。

因此，“在基于液滴的方法中，质量控制包括使用SoupX等工具去除环境RNA，该工具会估算空液滴中的背景RNA并将其从真实细胞图谱中扣除，” Lomeikaite谈道。2

在单细胞RNA测序中，根据线粒体和核糖体蛋白编码基因的比例，在分析过程中对细胞进行过滤尤为重要。这一步骤可去除死亡或应激细胞（线粒体含量高）以及代谢不活跃的细胞（核糖体含量低）。

“过滤是第一个关键步骤，重点在于去除低质量数据点和技术噪声，” Morrison解释说。“这包括排除背景噪声（如空液滴），以及剔除线粒体基因表达升高的死亡或濒死细胞。”当然，在设定过滤阈值时，也需要考虑生物学背景。

信号丢失与双细胞

非生物学方差的另一个来源是信号丢失事件。当转录本丰度极低以致无法被检测时，就会发生这种情况，导致读数为零，并使人们怀疑它们是否真的不存在。

“确保足够的测序深度，并通过MACS或FACS分离健康细胞，可缓解数据稀疏性，并最大限度地减少信号丢失事件的影响，” Lomeikaite说。

在基于液滴的单细胞RNA测序平台中，当液滴中包含两个或更多细胞时，就会发生双细胞或多细胞现象，从而产生误导性的混合表达谱，使下游分析结果失真。

Morrison指出，优化细胞浓度有助于限制双细胞和多细胞的发生。一些生物信息学工具（比如DoubletFinder）可帮助人们去除双细胞信号。

其他注意事项

对于数据分析而言，严谨的态度同样重要。“每次分析都是一个迭代的、假设驱动的过程，您可能需要测试参数、评估输出结果，或根据结果优化方法，” Smibert说。“计算工作是实验科学的自然延伸，而非与其割裂的。”

批次校正和数据归一化方法使得人们能够整合并比较不同批次的数据。Lomeikaite指出，SCTransform等分析方法可以“稳定方差，并考虑样本间测序深度的差异”。

“当今的[单细胞分析]平台能够生成极其丰富、高维度的数据，捕捉功能、空间背景和动态行为，” Hobbs指出。“但在实际操作中，我们会将这些数据压缩成低维表示形式，而在此过程中，我们往往丢弃了试图理解的信号本身。”

如今，新一代人工智能模型已具备整合多模态单细胞数据的能力。这将使机器学习能够更深入地挖掘数据，从而发现我们尚未察觉的真实生物信号。

“与其将数据强行压缩成易于可视化的形式，我们不如将数据导入能够处理其全部复杂性的系统中，”他说，“如果我们能做好这一点，就能从描述细胞行为转向预测细胞行为，而这将解锁下一代生物学。”

参考文献

1. Korsunsky, I., Millard, N., Fan, J. et al. Fast, sensitive and accurate integration of single-cell data with Harmony. Nat Methods 16, 1289–1296 (2019). https://doi.org/10.1038/s41592-019-0619-0

2. Matthew D Young, Sam Behjati, SoupX removes ambient RNA contamination from droplet-based single-cell RNA sequencing data, GigaScience, Volume 9, Issue 12, December 2020, giaa151, https://doi.org/10.1093/gigascience/giaa151