单细胞图谱揭示保守的IL-6-hepcidin轴协调大黄鱼肾脏抗菌防御与免疫病理

《Marine Life Science & Technology》：Single-cell landscapes reveal a conserved IL-6-hepcidin axis coordinates renal antibacterial defense and immunopathology in Larimichthys crocea

　　

硬骨鱼类肾脏是重要的造血器官和次级淋巴器官，但其应答全身性感染的细胞协调机制与调控回路仍知之甚少。本研究呈现了在坏死性病原菌杀鱼假单胞菌（Pseudomonas plecoglossicida）攻毒期间大黄鱼（Larimichthys crocea）肾脏的高分辨率单细胞转录组图谱。分析揭示了肾脏免疫微环境的深度重塑，其特征为髓系区室的显著扩增，以及由凋亡（apoptosis）、铁死亡（ferroptosis）和坏死性凋亡（necroptosis）组成的整合性细胞死亡特征的出现，该特征构成了典型内脏白色结节形成的基础。通过轨迹分析和RNA速率（RNA velocity）分析，研究人员证明细菌感染触发“紧急粒细胞生成（emergency granulopoiesis）”，驱动中性粒细胞、巨噬细胞和肥大细胞快速分化为高炎症状态。关键的是，研究人员鉴定出一种非经典、多谱系的抗菌反应，其中吞噬细胞是抗菌肽hepcidin的主要来源，且部分活化B细胞和调节性T细胞群体表现出额外的hepcidin相关特征。研究人员进一步确立IL-6-JAK2/STAT3信号通路为协调这一系统性防御的主调控轴。JAK2的药理学抑制消除了hepcidin的诱导，而外源性IL-6给药显著提高了宿主存活率并促进细菌清除。这些发现阐明了细胞因子介导的抗菌调控在进化上的保守性，并为早期脊椎动物器官水平的免疫协调提供了综合模型。

硬骨鱼类兼具先天性和适应性免疫系统，是研究脊椎动物免疫组织与多样化的关键进化模型。由于缺乏淋巴结和骨髓，硬骨鱼依赖肾脏尤其是头肾作为主要造血和次级淋巴器官，承担免疫谱系的产生、成熟与功能部署。大黄鱼（Larimichthys crocea）是东亚海水养殖的重要经济种，但持续受到坏死性病原菌杀鱼假单胞菌（Pseudomonas plecoglossicida）的威胁，该病原引起“内脏白色结节病”，表现为致死性全身炎症和器官衰竭。既往组织水平转录组研究虽已揭示大量抗菌相关通路，但无法解析细胞来源和免疫群体的功能异质性。因此，研究人员利用单细胞RNA测序（scRNA-seq）刻画感染过程中大黄鱼肾脏的细胞景观，以阐明肾造血连续体如何适应急性感染应激，并揭示保护性免疫与免疫病理的细胞基础。该研究发表于《Marine Life Science 》。

在技术方法上，研究人员从象山港水产种业有限公司获取健康大黄鱼（70–100 g），使用源自浙江省农业科学院的杀鱼假单胞菌ZJH1株进行腹腔注射攻毒，并采集PBS对照组和感染第4天的肾白细胞。主要方法包括：采用10× Genomics Chromium平台构建单细胞文库并进行Illumina NovaSeq 6000测序；使用Cell Ranger、DoubletFinder、Seurat和Harmony进行数据处理与整合；利用Monocle 2/3进行拟时序分析，velocyto进行RNA速率分析，CytoTRACE评估分化状态；结合bulk RNA-seq和GO、KEGG、GSEA富集分析；合成hepcidin-1/4成熟肽进行抗菌和抑菌圈实验；制备重组LcIL-6蛋白及多克隆抗体，在体外和体内使用JAK2抑制剂AG490与IL-6中和抗体验证信号轴；采用RT-qPCR和H&E染色进行基因表达和组织病理检测，并利用斑马鱼肾白细胞验证跨物种保守性。

结果方面，首先，大黄鱼肾脏单细胞图谱揭示造血微环境特征。通过scRNA-seq解析健康肾脏12个细胞簇，注释为中性粒细胞（mpx⁺）、巨噬细胞/髓系细胞（marco⁺mpeg1⁺）、B细胞（cd79a⁺）、T/NK细胞（cd3e⁺）、肥大细胞（cpa5⁺）、造血干/祖细胞（HSPCs；meis1b⁺gata1a⁺）和红系残留细胞。Monocle2轨迹和RNA速率分析显示HSPCs向髓系和淋巴系定向分化，证实成体大黄鱼肾脏具备功能完整的造血微环境。

其次，细菌感染诱导肾脏免疫景观广泛重塑。bulk RNA-seq和scRNA-seq显示感染后巨噬细胞/髓系区室从18.86%扩增至36.13%，而中性粒细胞、肥大细胞和B细胞比例相应下降；基因集富集分析（GSEA）揭示凋亡、铁死亡和坏死性凋亡的整合性“全死亡”特征，表明急性肾反应兼具病原清除与宿主免疫病理损伤。

第三，中性粒细胞轨迹分析鉴定从病原识别到抗菌效应状态的功能转变。12个中性粒细胞亚群（N0–N11）的轨迹末端为感染特异性N10亚群；早期状态表达tlr5、sec61a1a等病原识别和内质网应激基因，随后高表达il1b、tnfa、cxcl10等促炎因子，终末状态显著诱导il6和hamp。N10同时富集炎症反应、NF-κB信号以及坏死性凋亡和凋亡通路，提示过度炎症与细胞死亡参与白色结节形成。

第四，感染触发巨噬细胞向炎症和消退表型的分支重编程。8个巨噬细胞亚群中，M0、M4和M5呈M1样促炎特征（il1b、il6、tnfb、tnfa），M1、M6和M7呈M2样调节特征（stat6、tgfb1a、cd4-2）。RNA速率与拟时序分析显示稳态驻留亚群向效应亚群极化，其中感染响应的M7亚群表达B细胞相关基因并富集B细胞受体信号通路，提示该巨噬细胞谱系可能参与B细胞免疫调控。

第五，细菌感染驱动肾脏肥大细胞从增殖向炎症发育转变。5个肥大细胞亚群中，Mast-rps和Mast-pclaf为早期祖细胞，高表达rps2、rps8、pclaf和hmgb2；Mast-il1b/il6/il8为末端病原响应群体，表达il1b、il6、il8及mmp9、mmp13。感染后祖细胞池耗竭，细胞大量积累于高炎症亚群，表明肾脏肥大细胞可快速分化为特化抗菌效应细胞。

第六，淋巴细胞异质性揭示细菌感染期间特化炎症和抗菌程序。B细胞分为9个亚群，拟时序轨迹显示其从祖细胞（BC2、BC3、BC7）向浆细胞（BC5）和炎症分支（BC4、BC6、BC8）分化。T/NK细胞分为8个亚群，其中Treg样亚群T4表达foxp3b、il10以及hepcidin-like、mmp9和neurotoxin，提示调节性T细胞兼具免疫调节和抗菌作用。

第七，IL-6-JAK2/STAT3轴协调多谱系hepcidin抗菌反应。整合分析显示感染后hamp1、hamp3、hamp4、hamp5和hamp6显著上调，而hamp2下调；hepcidin主要在吞噬细胞中表达，部分活化B细胞和Treg样细胞也有低水平表达。合成的hepcidin-1和hepcidin-4对杀鱼假单胞菌、嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）和大肠杆菌（Escherichia coli）具有剂量依赖性抑菌和杀菌活性。在LPS协同下，重组LcIL-6可诱导hepcidin表达，而抗LcIL-6抗体和JAK2抑制剂AG490均可阻断该诱导。体内给予外源IL-6显著促进肾脏和脾脏细菌清除、提高存活率并减轻白色结节。斑马鱼肾白细胞中该调控轴同样存在，提示其在硬骨鱼类中保守。

讨论部分指出，大黄鱼肾脏在感染中经历器官范围的协同重编程，先天性和适应性免疫谱系趋向统一的抗菌效应状态。紧急粒细胞