利用基于质粒的报告系统对SARS-CoV-2 5′非翻译区的茎环结构进行功能分析

《Archives of Virology》：Functional analysis of stem-loop structures within the SARS-CoV-2 5′ untranslated region using a plasmid-based reporter system

　　

摘要

严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）的5′非翻译区（5′UTR）包含高度保守的茎环结构，这些结构调控病毒的基因表达。本研究使用基于质粒的哺乳动物表达系统，研究了选定的5′UTR茎环元件对报告基因表达的功能贡献。测试了五个构建体，这些构建体使用的是一种非整合型质粒：野生型（WT）5′UTR与GFP在CMV启动子下游融合，以及四个删除变异体（ΔB、ΔC、ΔD和ΔE），分别对应于茎环4（SL4）、SL4.5、SL5和SL5a的缺失。将这些构建体转染到HEK293细胞后，使用荧光微孔板读数器测量GFP的荧光强度，并通过RT-qPCR检测相对GFP转录本 abundance。与WT构建体相比，SL4的删除（ΔB）导致荧光强度和相对转录本 abundance显著降低，表明报告基因的表达显著减少。相比之下，SL4.5、SL5或SL5a的删除并未导致像ΔB那样的明显减少，尽管描述性的RT-qPCR分析显示这些变异体之间的相对转录本 abundance存在差异。对荧光数据的统计分析表明构建体之间存在显著差异（单因素方差分析，p < 0.05）。由于报告基因检测基于质粒表达，观察到的差异可能反映了转录、转录本 abundance、RNA稳定性和翻译的综合影响，而不仅仅是翻译本身。这些发现表明，在该实验系统中，SL4区域对报告基因的表达有显著贡献，而其他检测的茎环区域的作用相对较小。本研究为SARS-CoV-2 5′UTR的功能组织提供了额外的见解，并为未来旨在区分个别RNA结构元件的转录、转录后和翻译贡献的研究奠定了基础。