《Neurochemical Research》：Comparative Effects of Quercetin and its α- and β-D-glucoside Derivatives in LPS-Stimulated C6 Astroglial Cells
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神经炎症是中枢神经系统对损伤、感染或疾病的一种反应，涉及胶质细胞的激活以及细胞因子和活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）的释放。当这种反应持续存在或调节失调时，会促进神经系统疾病的进展。槲皮素（Quercetin, Que）是研究
神经炎症是中枢神经系统对损伤、感染或疾病的一种反应，涉及胶质细胞的激活以及细胞因子和活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）的释放。当这种反应持续存在或调节失调时，会促进神经系统疾病的进展。槲皮素（Quercetin, Que）是研究最广泛的黄酮类化合物之一；然而，其治疗应用受到低生物利用度的限制。因此，糖基化已成为改善黄酮类化合物理化性质和生物学特性的一种策略。研究人员先前合成了衍生物槲皮素-3’-α-D-葡萄糖苷（Quercetin-3’-α-D-glucoside, Que-3α），并表征了其药代动力学特征和体外细胞毒性。在此，研究人员在利用C6星形胶质细胞的脂多糖（Lipopolysaccharide, LPS）诱导炎症模型中，研究了Que及其衍生物的抗炎和抗氧化作用，包括新合成的Que-3α和天然存在的β-葡萄糖苷——槲皮素-3-β-D-葡萄糖苷（Quercetin-3-β-D-glucoside, Que-3β）。细胞用化合物（15 μM和30 μM）预处理2小时，然后用LPS（10 μg/mL）刺激24小时。这些化合物保持了线粒体活性，而Que和Que-3α降低了LPS诱导的ROS产生，提高了细胞活力，并减少了细胞凋亡和坏死。值得注意的是，Que-3α降低了诱导型一氧化氮合酶（inducible Nitric Oxide Synthase, iNOS）的表达，表明与苷元相比，它能更有效地调节炎症介质。这些发现强化了Que的生物学特性，并表明α-糖基化在保留Que有益作用的同时，增强了与神经炎症相关的药效学特征。
**论文解读：槲皮素及其α-和β-D-葡萄糖苷衍生物在LPS刺激的C6星形胶质细胞中的比较效应**
**研究背景与目的**
神经炎症是中枢神经系统（Central Nervous System, CNS）对感染、缺血、应激和创伤等多种伤害性刺激产生的复杂生物学反应，其特征是胶质细胞（主要是小胶质细胞和星形胶质细胞）的激活以及细胞因子、趋化因子和活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）等炎症介质的释放。虽然适度的神经炎症在早期具有保护和修复作用，但临床和临床前研究表明，其持续或过度激活会显著促进多种神经系统疾病的发病机制，如缺血性、退行性、创伤性、脱髓鞘性、癫痫性和精神性疾病。《柳叶刀·神经病学》发表的研究显示，2021年全球超过30亿人受神经系统疾病影响，CNS病理已成为全球疾病负担和残疾的首要原因。
目前针对炎症性疾病的常规慢性治疗主要依赖非甾体抗炎药（Non-Steroidal Anti-Inflammatory Drugs, NSAIDs）和皮质类固醇，但其长期使用伴随明确的副作用，如胃肠道溃疡、骨质疏松、肌肉分解代谢及代谢紊乱等。因此，寻找具有抗炎特性且药理安全性更优的天然化合物成为研究热点。黄酮类化合物是一类具有多种神经保护活性的分子，兼具抗氧化和抗炎作用。其中，槲皮素（Quercetin, Que）作为膳食黄酮的代表，广泛存在于水果和蔬菜中，已被证实具有抗氧化、抗病毒、抗癌和抗炎等特性。尽管Que具有诸多益处，但其水溶性差和生物利用度低严重限制了其临床应用。
糖基化被认为是改善生物活性化合物理化性质的有效策略，可能影响分子穿越血脑屏障（Blood-Brain Barrier, BBB）的能力。相较于自然界中常见的β-糖苷，α-构型的糖苷键在自然界中不常见，可能赋予分子独特的理化和生物学特性。研究人员此前合成了Que的α-葡萄糖苷衍生物Que-3α，并表征了其药代动力学特征和体外细胞毒性。本研究旨在利用脂多糖（Lipopolysaccharide, LPS）诱导的C6星形胶质细胞炎症模型，系统比较Que、新合成的α-葡萄糖苷衍生物Que-3α以及天然存在的β-葡萄糖苷衍生物Que-3β（异槲皮苷）的抗炎和抗氧化效应，以评估糖基化结构修饰是否改变分子相较于苷元的保护作用。
**主要技术方法**
研究人员使用了以下关键技术方法开展研究：采用酶法转糖苷作用合成Que-3α，具体使用修饰的蔗糖磷酸化酶BaSP Q345F；使用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物（MTT）法评估线粒体活性；使用2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯（H?DCFDA）荧光探针检测细胞内ROS产生水平；采用吖啶橙（AO）/碘化丙啶（PI）双染法评估细胞活力、凋亡和坏死；使用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测炎症介质TNF-α、iNOS、COX-2和IL-6的mRNA表达水平。本研究所用C6大鼠星形胶质细胞系购自里约热内卢细胞库。
**研究结果**
**槲皮素及衍生物Que-3α和Que-3β保持线粒体活性**
通过MTT实验发现，LPS暴露显著降低了线粒体活性，证实了其细胞毒性作用。Que和Que-3α在15 μM和30 μM两种浓度下均能显著减轻LPS诱导的线粒体活性降低，表现出对线粒体功能的保护作用。对于Que-3β，仅最低浓度（15 μM）能恢复LPS暴露细胞的线粒体活性，而最高浓度（30 μM）未能阻止LPS诱导的降低。各分子在相同条件下未观察到显著差异。
**槲皮素及衍生物Que-3α阻止LPS诱导的C6细胞内ROS产生**
利用H?DCF-DA荧光实验检测发现，LPS暴露显著增加了ROS水平。Que和Que-3α在两种测试浓度下均能显著降低LPS诱导的ROS产生。相比之下，Que-3β在低浓度（15 μM）下未能显著改变LPS暴露细胞的ROS水平，而高浓度（30 μM）在基础条件下反而增加了ROS产生，且两种浓度均无法降低LPS诱导的ROS水平。
**槲皮素和Que-3α阻止LPS诱导的细胞死亡**
通过AO/PI染色评估细胞活力、凋亡和坏死。结果显示，LPS显著降低了细胞活力，并显著增加了凋亡和坏死细胞的比例。Que和Que-3α预处理能完全阻止LPS诱导的细胞毒性，将细胞活力维持在接近对照组水平，并显著降低凋亡和坏死细胞百分比。值得注意的是，与Que和Que-3α不同，Que-3β单独处理即显著降低活细胞百分比并增加坏死，且在LPS刺激下未能提供保护作用。
**槲皮素和Que-3α对LPS诱导的炎症标志物表达的影响**
由于Que-3β未表现出保护作用，此部分实验仅针对Que和Que-3α进行。LPS暴露显著增加了TNF-α和iNOS的mRNA表达。Que联合LPS进一步增强了TNF-α和iNOS的表达。而Que-3α联合LPS组的TNF-α表达显著低于Que联合LPS组，iNOS表达则显著低于LPS组和Que联合LPS组，且与对照组无显著差异。三组间COX-2表达无显著变化。Que单独处理显著增加了IL-6表达，而Que-3α单独或联合LPS均未改变IL-6水平，且Que-3α联合LPS组的IL-6表达显著低于Que联合LPS组。
**讨论与结论总结**
本研究结果证实，Que和其α-葡萄糖苷衍生物Que-3α均能显著减轻LPS诱导的线粒体损伤和ROS增加，并表现出抗凋亡和细胞保护特性。值得注意的是，Que-3α在调节iNOS表达方面表现出优于Que的效应，这提示α-糖基化可能影响Que的生物学行为。相比之下，β-葡萄糖苷衍生物Que-3β的保护作用有限，高浓度甚至增加基础ROS水平并诱导细胞死亡，表明糖基化的生物学效应不仅取决于葡萄糖基团的存在，还取决于糖苷键的立体化学构型。
Que-3α和Que-3β仅糖苷键立体构型不同却表现出截然不同的生物活性，这种微妙的立体化学差异可影响分子构象、氢键模式、理化性质及与酶和生物靶标的相互作用。研究未在蛋白水平量化炎症介质，也未评估Nrf2、MAPK等信号通路，因此无法得出机制性结论。
结论部分指出，本研究数据强化了Que已知的生物学特性，并赋予了研究人员合成的α-葡萄糖苷衍生物Que-3α特殊的意义，因为α-构型糖苷在该黄酮类化合物中的报道很少见，且此前尚无其在神经炎症模型中生物活性的评估。研究结果首次证明，α-糖基化在实验条件下保留了Que的细胞保护和抗氧化作用，并可能影响特定反应。鉴于Que的药代动力学局限性，α-糖基化是生成具有改善生物活性潜力的衍生物、未来应用于神经炎症模型的有前景的结构策略。未来研究需通过体内神经炎症和神经退行性变模型确认其治疗潜力，并重点评估NF-κB、MAPK（p38/JNK）、PI3K/STAT等炎症信号通路，以及Nrf2/Keap1/HO-1/NQO1抗氧化信号网络和SIRT1通路。该研究为理解黄酮类化合物糖基化修饰的结构-活性关系提供了重要实验依据。
