《Virus Genes》：Virome of neotropical Sabethes mosquitoes reveals two novel viruses in the Spiciviridae family
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Spiciviridae家族属于Ghabrivirales目，目前仅包含一个官方认可的属Spicivirus。然而，宏基因组学研究已揭示相关病毒的多样性日益增加，表明当前的分类可能低估了其进化复杂性。在此背景下，本研究旨在检测和表征库蚊科(Culicidae)
Spiciviridae家族属于Ghabrivirales目，目前仅包含一个官方认可的属Spicivirus。然而，宏基因组学研究已揭示相关病毒的多样性日益增加，表明当前的分类可能低估了其进化复杂性。在此背景下，本研究旨在检测和表征库蚊科(Culicidae)蚊子中与Spiciviridae相关的新病毒。研究人员共对19个蚊子混合样本池进行了测序，并采用宏基因组学方法和生物信息学工具进行分析。其中，在四个混合样本池(S4、S11、S18和S19)中鉴定出两种新病毒，暂命名为Sabethes病毒1(SV1)和Sabethes病毒2(SV2)。系统发育推断揭示了具有强统计支持的进化分支，且RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)蛋白的遗传差异大于20%。这些发现有助于对Spiciviridae相关基因组多样性的详细分析。尽管Spicivirus目前是唯一被官方认可的属，但研究结果表明，可能存在尚未被ICTV描述的新分类群。
**新热带Sabethes蚊子病毒组研究：Spiciviridae家族两个新病毒的发现与进化分析**
**一、研究背景与科学问题**
蚊子(昆虫纲双翅目蚊科Culicidae)是影响全球健康的重要病原体传播媒介，可向人类和动物传播病毒、原生动物和蠕虫。除致病作用外，这些昆虫还携带大量未被充分研究的病毒组(virus组)。宏基因组学方法已揭示蚊子体内存在广泛且特征不明的病毒多样性，极大扩展了人们对节肢动物病毒圈的认识，并为理解病毒进化和新发传染病风险提供了重要信息。
Spiciviridae家族属于双RNA病毒门(Duplornaviricota)、色褐病毒纲(Chrymotiviricetes)、Ghabrivirales目，于2025年由国际病毒分类委员会(ICTV)正式建立，目前包含Spicivirus属内的13个物种。值得注意的是，尽管该家族仅有一个官方认可的属，但宏基因组研究已不断揭示相关病毒的多样性日益增加，提示现有分类可能低估了其进化复杂性。Spiciviridae已在极其广泛的宿主中被鉴定，包括植物(柿树)、寄生绦虫(Schistocephalus solidus)、植食性昆虫(如葱蓟马Thrips tabaci、葡萄带叶蝉Scaphoideus titanus、甜菜叶蝉Circulifer tenellus、豆扁平蜡蝉Spissistilus festinus、烟粉虱Bemisia tabaci)以及蚊子(如沙氏伊蚊Aedes camptorhynchus、埃及伊蚊Aedes aegypti和环跗库蚊Culex vishnui)。基因组层面，Spiciviridae拥有非节段双链RNA(dsRNA)基因组，包含两个开放阅读框(ORF)，分别编码脯氨酸-丙氨酸富集蛋白(PArP)和RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)。有证据表明这些病毒可能缺乏衣壳，这在dsRNA病毒中属于非典型特征。其广泛的宿主范围和独特的基因组结构使其成为研究节肢动物RNA病毒进化的关键类群。
在此背景下，本研究旨在表征巴西圣保罗州Sabethes蚊子中与Spiciviridae家族相关的病毒，重点关注其基因组结构、宿主关联及该新兴病毒家族内的进化关系。
**二、研究内容与主要结论**
研究人员于2019年10月至2020年3月期间，在巴西圣保罗州多个城市采集了738只蚊科标本，经形态学鉴定后分为19个蚊子混合样本池(pool)进行病毒宏基因组分析。通过测序和生物信息学分析，研究人员在四个混合样本池(S4、S11、S18和S19)中检测到与Spiciviridae家族相关的病毒序列，这些样本分别来自Sabethes aurescens、Sabethes identicus和Sabethes albiprivus三个不同物种，采集地点包括Guarulhos、Igaratá和Mat?o，植被类型均为大西洋森林生物群落的半落叶季节性森林。其中两个混合样本池(S11和S19)产生了完整或近乎完整的病毒基因组序列。
通过成对核苷酸序列比较，研究人员将S4和S11池中的序列鉴定为同一病毒的不同分离株(共享99.68%核苷酸一致性)，命名为Sabethes病毒1(SV1)；将S18和S19池中的序列(共享99.47%一致性)命名为Sabethes病毒2(SV2)。基因组特征分析显示，SV1和SV2具有非节段dsRNA基因组，大小范围为5019至6268个核苷酸(nt)，GC含量估计在44.99%至47.96%之间。基因组结构分析表明，两种病毒均包含两个ORF：位于5′端的ORF1富含脯氨酸和丙氨酸区域，位于3′端的ORF2编码RdRp。RdRp催化结构域分析鉴定出保守基序A、B和C，这些基序在已分类和未分类的Spiciviridae病毒中高度保守，尤其在motif C中几乎不变，提示共同的进化起源。系统发育分析显示，SV1和SV2与所有具有显著同源性的未分类序列均聚类在Spiciviridae家族内部，且具有高统计支持(>90%)。SV1和SV2在RdRp区域共享56.24%的氨基酸一致性，这一数值远低于ICTV规定的Spiciviridae家族新物种划分的70%氨基酸一致性阈值，因此研究人员建议SV1和SV2代表该家族中的两个潜在新种。
**三、主要关键技术方法**
本研究采用的主要技术方法包括：(1)基于Illumina MiSeq平台的宏基因组测序(双端150bp读长)；(2)使用Trimmomatic进行质量控制和修剪，rnaSPAdes进行从头组装，Kraken 2进行分类学注释，BLASTn/BLASTx/BLASTp进行同源性搜索；(3)利用ORFfinder预测开放阅读框，通过NCBI保守结构域数据库(CDD)、Motif Finder、Palmscan和LucaProt鉴定保守结构域；(4)使用MAFFT进行多序列比对，IQ-TREE2在最大似然框架下构建系统发育树(1000次自举检验)；(5)使用MEGA v12估算进化距离，SDT v1.2通过MUSCLE算法计算成对序列一致性。
**四、研究结果详解**
**1. 库蚊科蚊子中Spiciviridae家族病毒的检测**
在四个蚊子混合样本池(S4、S11、S18和S19)中检测到两条完整病毒序列(SV1_Si/S11和SV2_Sap/S19)和两条部分序列(SV1_Sa/S4和SV2_Sap/S18)，均来自Sabethes属蚊子的三个不同物种。BLASTx分析显示，SV1与Enontekio totivirus 2(UUV42408)具有50.61%和50.10%的氨基酸一致性(覆盖率34%和47%)，SV2与未表征的dsRNA病毒具有49.95%和52.73%的氨基酸一致性(覆盖率64%和46%)，表明存在进化关系但具有显著分化。
**2. 与Spiciviridae相似病毒的比较分析**
成对核苷酸一致性比较确认了SV1和SV2的分类归属；BLASTx搜索结果显示SV1和SV2与已知病毒的最高氨基酸一致性均低于53%，远低于同一家族内物种间的典型水平，表明它们代表了独特的病毒谱系。
**3. SV1和SV2病毒的基因组特征**
SV1和SV2基因组大小和GC含量与Spiciviridae家族已知成员(如Schistocephalus solidus toti-like virus 2，6090nt；Thrips tabaci associated dsRNA virus 2，8727nt)一致，基因组中两个ORF的排列方式与Spiciviridae家族典型基因组结构相符。
**4. SV1和SV2的ORF及保守结构域分析**
ORF1与Aedes japonicus toti-like virus 1(WCJ14330)一致性最高；ORF2(RdRp)与Enontekio totivirus 2(UUV42408)和Joutseno totivirus(UUV42284)具有相似性。SV1的ORF1中鉴定出UL36 tegument蛋白结构域(PHA03247，位置8-313)和一个未知功能结构域(DUF5585，位置131-290)；SV2的ORF1中检测到疱疹病毒主要外膜糖蛋白结构域(BLLF1，pfam05109，位置15-210)。这些非典型结构域表明低复杂度区域的相似性，需要进一步的实验验证。
**5. Spiciviridae RdRp催化基序的比较**
LucaProt功能预测将SV1和SV2的RdRp蛋白分类为病毒蛋白(概率=1.0)。催化结构域分析鉴定出保守基序A、B和C，这些基序在未分类病毒(如UUV42408、AJT39579、WCJ14331和UUV42284)与已分类的Spiciviridae成员之间高度保守，motif C位置几乎不变，表明这些基序可作为Spiciviridae家族分类界定的分子标记。
**6. Spiciviridae的系统发育推断**
基于RdRp氨基酸序列的最大似然系统发育树(LG+F+R9模型)显示，SV1和SV2与来自不同地理区域(欧洲、亚洲、大洋洲和北美洲)的蚊子来源病毒形成宿主特异性进化分支。与Sabethes病毒密切相关的分支包括：库蚊属相关病毒形成两个亚支(Culex 1和Culex 2)；伊蚊属相关病毒分为三个独立分支(Aedes 1-3)；Ochlerotatus属相关病毒形成四个独立分支(Ochlerotatus 1-4)。非蚊科宿主病毒(如绦虫、水生昆虫、植食性昆虫和植物)在系统发育树上形成更远距离的独立分支。此外，Spicivirus属内某些已命名物种(如Spicivirus shichi、Spicivirus roku等)与其他成员形成独立且支持良好的分支，提示家族内可能包含多个尚未识别的属。
**7. 基于RdRp的进化距离分析**
进化距离比较显示，Sabethes病毒与Ochlerotatus 1-3分支(距离0.11-0.14)以及Aedes 1和3分支(距离0.15和0.27)距离较近；Aedes 3与Ochlerotatus 3之间的距离仅为0.03，表明这些类群可能是密切相关的谱系或源自共同祖先。Culiseta和Mansonia分支距离较远(0.27至0.44)，非蚊科宿主病毒显示出更大的距离(>0.52)。这些结果表明Spiciviridae家族的起源和多样化与蚊子密切相关，非蚊科宿主病毒代表了更古老的谱系或独立的跨物种传播事件。
**五、讨论与结论总结**
讨论部分指出，SV1和SV2在Sabethes属蚊子中的发现扩展了该病毒家族的已知宿主范围和地理分布。Sabethes蚊子是森林性物种，在竹节间繁殖，是大西洋森林中黄热病病毒和其他虫媒病毒的次要传播媒介，在农村和城郊地区Haemagogus蚊子可能缺失的情况下发挥病毒维持作用。尽管本研究中未检测到虫媒病毒，但基因组和系统发育分析提供了令人信服的证据，表明SV1和SV2代表Spiciviridae家族中两个不同的新物种。Spiciviridae家族内病毒形成的宿主特异性分支和显著的进化距离表明该家族可能包含多个未被识别的属，可能反映了蚊子宿主内的古老辐射进化。非蚊科宿主中发现的较远相关病毒可能代表独立的跨物种传播事件或更古老的进化谱系。
本研究成功鉴定并表征了两种与蚊子相关的新型病毒SV1和SV2，它们是Spiciviridae家族的新成员。在新热带Sabethes属蚊子中的发现扩展了该家族的生态分布。综合研究表明：SV1和SV2是丰富了Spiciviridae遗传多样性的不同病毒物种；该家族与蚊子中鉴定的其他序列显示出清晰的关系模式，表明古老而稳定的关联；家族内的系统发育结构和成对距离提示可能存在与不同宿主相关的新属级分类单元，随着新序列的鉴定，可能需要进行分类学修订。未来研究应在细胞培养中分离这些病毒以确认其昆虫特异性并研究其复制周期，更广泛的地理和宿主采样将有助于阐明Spiciviridae家族的起源和完整宿主范围，所提出的属级多样性应由ICTV依据遗传标准和系统发育证据进行正式评估。理解这些看似非致病病毒的生态学和进化有助于更全面地认识蚊子病毒组，并为病毒-宿主相互作用和虫媒病毒起源模型提供参考。该论文发表于《Virus Genes》。
