转录组学分析鉴定 FABP5 作为代谢功能障碍相关脂肪肝脂质蓄积的候选调控因子

《Frontiers in Endocrinology》：Transcriptomic analysis identifies FABP5 as a candidate regulator of lipid accumulation in metabolic dysfunction-associated fatty liver disease

　　

目的：代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MAFLD）发病机制复杂且尚未完全阐明。本研究旨在通过牛津纳米孔技术（ONT）转录组测序鉴定MAFLD发病中差异表达基因，并探讨脂肪酸结合蛋白5（FABP5）在肝脂质蓄积中的潜在作用。方法：雄性C57/BL6N小鼠分别饲喂高脂高果糖（HFHF）饮食19周诱导MAFLD或标准饲料。肝组织行组织学检查与ONT转录组分析，筛选出的脂质转运与代谢差异基因经定量逆转录聚合酶链反应（RT-qPCR）验证。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定HFHF小鼠及MAFLD患者血清FABP5浓度。体外以不同浓度棕榈酸（PA）处理Huh-7细胞诱导脂质蓄积，随后在PA处理细胞中过表达FABP5，评估胞内脂质蓄积及脂肪酸氧化相关基因表达。结果：HFHF小鼠呈现显著肝脂肪变性、肝细胞气球样变及小叶炎症。ONT转录组鉴定出400个差异表达基因，含12个脂质转运代谢相关基因。RT-qPCR证实肝Fabp5在HFHF小鼠中显著下调，与ONT一致。HFHF小鼠及MAFLD患者血清FABP5浓度均显著低于各自对照。PA呈浓度依赖性诱导Huh-7细胞脂质蓄积；FABP5过表达减轻PA诱导的脂质蓄积，并上调PPARα（过氧化物酶体增殖物激活受体α）及其他脂肪酸氧化基因。结论：实验性与人类MAFLD中肝Fabp5表达及循环FABP5浓度均降低。恢复FABP5可减轻肝细胞来源细胞PA诱导的脂质蓄积，伴PPARα等脂肪酸氧化基因表达增加，提示FABP5是肝脂质代谢的候选调控因子，值得作为MAFLD潜在治疗靶点进一步研究，但需追加抑制与 Rescue 实验确认PPARα是否为必要介导因子。

研究背景方面，非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）以无显著饮酒下肝脂质过度蓄积为特征，其谱带涵盖单纯脂肪变性至肝细胞癌，全球约四分之一人口受累。因系统性代谢功能障碍在发病中的核心作用，学界提出代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MAFLD）概念，强调肝脂肪变性与超重肥胖、2型糖尿病或其他代谢异常共存。肝脂质代谢失调是MAFLD主征，表现为脂肪酸摄取与甘油三酯合成增加、脂肪酸氧化与脂质输出受损。转录组学研究已揭示脂肪酸转运、脂滴形成、甘油三酯合成及脂肪酸氧化相关基因改变，为筛选候选调控因子提供路径。脂肪酸结合蛋白5（FABP5）是14–15 kDa胞质脂质伴侣，结合长链脂肪酸并调控其胞内转运、代谢利用及向核受体递送，尤其关联PPARβ/δ脂质代谢程序，并涉入全身能量稳态与炎症；但其在脂肪性肝病中的表达与功能随疾病背景、组织区室及细胞来源而异，循环FABP5证据有限。研究人员据此采用ONT全长转录组测序表征HFHF饮食小鼠肝基因表达改变，锁定Fabp5为脂质转运代谢差异基因，进而在实验性与人类MAFLD中评估肝Fabp5与循环FABP5，并在Huh-7细胞考察FABP5过表达对PA诱导脂质蓄积及脂肪酸氧化基因的影响，论文发表于《Frontiers in Endocrinology》。

主要关键技术方法概括：研究人员构建两类动物模型，一是雄性C57BL/6N小鼠饲喂60%脂肪伴42 g/L果糖水HFHF饮食19周（n=4/组），二是独立队列C57BL/6N小鼠喂蛋氨酸胆碱缺乏（MCD）饮食2周或8周（n=5/组）；人类样本为20例MAFLD患者与20例健康对照血清。转录组采用ONT cDNA-PCR测序（PromethION平台），经minimap2比对GRCm38、Pinfish校正、DESeq2筛选|log₂FC|≥1且FDR<0.01的差异基因，并与eggNOG“脂质转运与代谢”类交集；体外以Huh-7细胞用0.4–0.8 mmol/L PA–BSA共轭物处理24小时造脂质蓄积模型，Lipofectamine 2000转染FABP5质粒过表达；辅以RT-qPCR、Oil Red O染色定量、Western blot、ELISA及公开数据集GSE67678（转录组）与PXD077557（蛋白质组）再分析。

研究结果部分，小标题“HFHF喂养诱导小鼠肝损伤与全局转录组改变”中，19周HFHF小鼠H&E示大泡性脂肪变、小叶炎症浸润与气球样变，NAS评分各分项显著升高，无显著纤维化；血清ALT、AST、TC、TG均升；ONT获400 DEGs（201上/199下），MA图、火山图、聚类热图显示组间分离。“功能富集鉴定12个脂质转运代谢差异基因”中，GO、KEGG富集于脂肪酸代谢/降解、PPAR信号等，eggNOG交集得8上调和4下调共12基因（含Fabp5下调log₂FC=?3.40、FDR=7.10E-12），RT-qPCR方向全一致。“循环FABP5浓度在HFHF小鼠与MAFLD患者均降低”中，ELISA示HFHF小鼠及人类MAFLD血清FABP5显著低于对照（n=4鼠、n=20人）。“MCD饮食脂肪变中肝FABP5免疫反应性下降”中，MCD 2周/8周肝steatosis评分递增，FABP5免疫组化强度递减。“独立公开数据集支持饮食性脂肪肝肝Fabp5/FABP5降低”中，GSE67678的WD/SW 8周鼠Fabp5 mRNA低于chow（Welch t P=0.0468）；PXD077557中HFHFD肝FABP5蛋白log₂丰度低于CON（名义P=0.00144，BH校正FDR=0.2529不显著）。“PA诱导Huh-7脂质蓄积并改变脂肪酸氧化基因”中，0.4–0.8 mmol/L PA剂量依赖增脂滴，FABP5与PPARα mRNA在0.4/0.6 mmol/L下调，CPT1A上调，ACOX1在0.6 mmol/L上调，选0.6 mmol/L作后续。“FABP5过表达减轻PA脂质蓄积并伴脂肪酸氧化基因上调”中，转染确认FABP5蛋白/mRNA高表达，0.6 mmol/L PA下OE组Oil Red O面积少于对照/空载体，PPARα、CPT1A、ACOX1 mRNA同步上调。

讨论部分总结：研究人员指出12基因为预设生信流程（DESeq2阈值∩eggNOG I类）选出非主观，Fabp5下调在MCD、GSE67678、PXD077557跨平台方向一致，但PXD077557蛋白水平未过多重校正；循环FABP5降低不能等同肝源释放，因FABP5属胞质蛋白，可经非经典分泌、胞外囊泡或细胞更替入血，且人类仅20对未校代谢混杂，不足以立生物标志物。与Westerbacka等人人类肝FABP5上调报道相左，可因物种、饮食时长、病期（单纯脂肪变vs炎纤）、bulk肝含巨噬细胞等FABP5高表达群体致反向；FABP5在肝细胞可能缓冲脂肪酸促氧化，在巨噬细胞经AMPK/NF-κB调炎，功能具细胞特异性。体外过表达伴PPARα/CPT1A/ACOX1升但未做敲低/抑制剂Rescue，不能断言PPARα为必要介质，FABP5更经典递配体予PPARβ/δ；PA本身升CPT1A/ACOX1或为代偿非流量证明。局限含动物/人样本小、原HFHF肝蛋白未测、Huh-7过表达非生理、缺耗氧/棕榈酸氧化通量。结论翻译：利用ONT肝转录组在HFHF小鼠鉴定12个脂质转运代谢DEG且RT-qPCR全验证，Fabp5持续下调；FABP5过表达减轻Huh-7的PA脂质蓄积并伴脂肪酸氧化基因升；FABP5列为肝细胞脂质代谢候选调控因子，需细胞特异性机制与体内干预实验定其诊断治疗价值。