《Frontiers in Neuroscience》：The spectrum of C9orf72 repeat lengths in Portuguese frontotemporal dementia and amyotrophic lateral sclerosis patients: from pathogenic expansions to intermediate alleles
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摘要
引言：额颞叶痴呆与肌萎缩侧索硬化症是临床上截然不同的两种疾病，但二者具有共同的遗传病因，其中C9orf72基因中的致病性六核苷酸重复扩增是这两种疾病最常见的遗传病因。本研究旨在确定葡萄牙中部地区FTD和/或ALS患者及其高风险亲属中C9orf72重复扩
摘要
引言：额颞叶痴呆与肌萎缩侧索硬化症是临床上截然不同的两种疾病，但二者具有共同的遗传病因，其中C9orf72基因中的致病性六核苷酸重复扩增是这两种疾病最常见的遗传病因。本研究旨在确定葡萄牙中部地区FTD和/或ALS患者及其高风险亲属中C9orf72重复扩增的频率，并分析该队列中中间等位基因的分布和重复大小，探讨其潜在的致病性。
方法：在2016年1月至2026年1月期间，研究人员对610例具有FTD/ALS谱系临床表型的患者及63例无症状亲属进行了C9orf72重复扩增检测。采用包含STR-PCR和RP-PCR的两步PCR方案鉴定C9orf72重复扩增，随后使用商业试剂盒进行重复长度测定。毛细管电泳图谱随后使用AmplideX? PCR/CE Reporter软件进行分析。此外，携带中间等位基因的个体接受了全面的临床、液体生物标志物和神经心理学评估，以研究这些等位基因的潜在致病性。
结果：在11%的患者中鉴定出致病性C9orf72扩增。绝大多数携带长片段扩增（>145次重复），而3例患者表现出38至78次重复的较短扩增。在7名受试者中发现中间等位基因，其临床表现具有异质性。临床上，这些个体与携带较长扩增的个体无法区分。
讨论：C9orf72六核苷酸重复扩增是该队列中FTD、ALS和FTD-ALS患者的主要遗传病因，凸显了基因检测对于准确咨询和临床管理的重要性。这些发现支持对所有患有这些疾病的患者进行常规C9orf72检测，尤其是具有欧洲血统的患者。研究结果还支持了新兴观点，即中间型C9orf72重复扩增可能作为遗传风险因素，促成广泛的临床表型谱。
**论文解读：葡萄牙FTD/ALS谱系患者C9orf72重复长度谱系研究**
**一、研究背景与目的**
额颞叶痴呆（frontotemporal dementia, FTD）和肌萎缩侧索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis, ALS）是两种在临床上截然不同的神经退行性疾病。FTD主要影响额叶和颞叶，导致行为、社交认知和语言功能的改变，是早发性痴呆的第二大常见病因，在45–65岁人群中患病率约为15/10万。ALS则主要累及上、下运动神经元，导致反射亢进、痉挛、肌束颤动、进行性肌无力和肌肉萎缩，是成人最常见运动神经元病，患病率约为5/10万，典型发病年龄在60岁以后。然而，这两种疾病在临床、遗传和神经病理学上存在显著重叠，现已被认为是FTD/ALS连续谱系的两端。约30%的FTD患者会出现运动功能障碍，高达50%的ALS患者表现出与FTD相关的症状，且两种疾病可在同一家族甚至同一患者中同时出现。
C9orf72基因非编码区的GGGGCC（G4C2）六核苷酸重复扩增于2011年被鉴定为连接染色体9p的FTD和ALS的遗传病因（DeJesus-Hernandez et al., 2011; Renton et al., 2011; Gijselinck et al., 2012）。此后的多项研究证实，C9orf72重复扩增是欧洲人群ALS最常见的遗传病因，占家族性病例的39.6%和散发性病例的4.6%；同时也是FTD的重要病因，见于18.5%的家族性和6.3%的散发性FTD病例。然而，C9orf72重复扩增的频率在世界各地存在显著地理差异，斯堪的纳维亚国家报道的频率最高，而亚洲人群中通常较为罕见。健康个体通常携带2–20次重复的等位基因，而C9orf72相关ALS和FTD患者的扩增通常为数百至数千个G4C2重复单元。目前提出的病理阈值约为30次重复单元，但精确的界定标准尚未最终确立。处于20–30次重复范围的中间等位基因被认为可能是疾病的风险等位基因，但其致病意义仍不明确。
基于上述背景，本研究旨在：①确定葡萄牙中部地区FTD和/或ALS患者及其高风险亲属中C9orf72重复扩增的频率；②分析该患者队列中中间等位基因的分布和重复大小；③对中间等位基因携带者进行全面的临床、液体生物标志物和神经心理学评估，探讨其潜在致病性。
**二、主要技术方法**
该研究为一项为期10年（2016年1月至2026年1月）的单中心队列研究，在葡萄牙科英布拉大学神经科学与细胞生物学中心（CNC）神经遗传学实验室开展。研究纳入673名受试者，包括610例具有FTD/ALS谱系临床表型的患者和63例无症状家族成员。患者来源于科英布拉地方卫生单位（ULS-Coimbra）神经内科的痴呆和神经肌肉专科门诊，无症状亲属来源于医学遗传学系的遗传咨询门诊。C9orf72扩增检测采用两步PCR方案：首先进行STR-PCR鉴定C9orf72等位基因，对仅显示单一等位基因峰的样本使用重复引物PCR（RP-PCR）确认扩增等位基因的存在。重复长度定量使用AmplideX? PCR/CE C9orf72商业试剂盒（Asuragen, Inc.），通过三步引物重复引物PCR构型扩增G4C2重复区域，在3500基因分析仪上进行毛细管电泳分离，使用AmplideX? PCR/CE Reporter软件进行片段分析。脑脊液（CSF）样本遵循BIOMARKAPD标准化方案采集和处理，CSF-AD生物标志物（Aβ42、Aβ40、t-tau、p-tau181）采用LUMIPULSE G600II平台自动免疫测定，并按AT(N)方案分类；CSF神经丝轻链（NfL）使用验证的ELISA定量。携带中间等位基因的个体进行了全面神经心理学评估，量表包括简易精神状态检查（MMSE）、蒙特利尔认知评估（MoCA）及里斯本痴呆评估成套量表（BLAD）。
**三、研究结果**
**3.1 队列特征与C9orf72扩增频率**
在610例患者中，临床表型包括373例FTD、112例ALS、34例FTD-ALS、38例FTD-不典型帕金森特征和53例阿尔茨海默病（AD）。在87名受试者中鉴定出致病性C9orf72扩增，包括65例患者（占患者队列的11%）和24例无症状亲属（占家族成员队列的38%）。各临床亚型中的频率为：FTD-ALS最高（21%），其次为ALS（14%）和FTD（11%）。在具有不典型帕金森特征或AD的患者中未检测到C9orf72扩增。绝大多数扩增携带者具有长片段扩增（>145次重复），仅3例患者表现出38、63和78次重复的较短扩增。
**3.2 等位基因大小分布**
对队列整体等位基因大小分布的分析显示，2次重复等位基因最常见，其次为5次和8次重复，三者合计占所有观察到等位基因的60%以上。14–18次重复的等位基因不常见，约占总数的0.7%。未在任何患者中发现3次和19次重复等位基因。由于方法学限制，大于145次重复的等位基因无法准确定量，故绝大多数扩增等位基因被分类为>145次重复。
**3.3 中间等位基因携带者的临床特征**
共鉴定出7例中间等位基因（20–30次重复）携带者，包括6例患者和1例无症状个体，重复大小为20–23次重复，临床表现异质性显著。其中2例（Case #1和#5）表现为FTD-ALS，CSF-AD生物标志物正常，NfL升高与临床表型一致；2例（Case #2和#7）表现为原发性进行性失语（PPA）合并AD语言变异型，CSF-AD生物标志物呈A+T+N+模式；1例（Case #3）表现为轻度认知障碍（MCI）合并轻度行为障碍（MBI），CSF生物标志物谱正常；1例（Case #4）表现为路易体痴呆；1例为无症状个体（Case #6），为Case #4之子，携带相同大小的20次重复等位基因。临床上，中间等位基因携带者与长片段扩增携带者无法区分。
**四、讨论与结论**
本研究是葡萄牙最大的诊断队列之一，证实C9orf72重复扩增是葡萄牙中部地区FTD、ALS和FTD-ALS的重要遗传病因，频率与西欧其他国家的研究结果一致，支持对FTD/ALS谱系患者进行常规C9orf72基因检测的建议。正常C9orf72等位基因的大小分布（以2、5、8次重复为主）与其他欧洲人群（如比利时佛兰德斯人群）高度相似，表明葡萄牙人群中正常C9orf72等位基因分布与欧洲其他地区基本一致。PSP、CBD和AD患者中未检出C9orf72扩增，提示这些疾病在葡萄牙人群中具有不同的遗传基础。
在方法学层面，STR-PCR联合RP-PCR及商业片段分析试剂盒的检测流程能够可靠鉴定致病性扩增，但无法精确定量>145次重复的等位基因。两种检测方法在检测扩增等位基因方面具有完全一致性，支持当前诊断工作流程的可靠性。
关于中间等位基因，本研究对7例携带者的综合临床、神经心理学和生物标志物评估提示，20–23次重复范围内的等位基因可能促成广泛的神经退行性表型易感性。值得注意的是，在一家系中，父亲（Case #4）和儿子（Case #6）携带相同大小的20次重复等位基因，未观察到中间等位基因的代间不稳定性，与先前报道一致。
**研究局限性**包括：缺乏采用相同方法学检测的匹配健康对照组，无法直接比较患者与一般人群之间的等位基因频率；分子方法无法精确定量>145次重复的极长扩增，也无法在序列水平表征重复中断，后者可能影响重复稳定性、扩增效率和临床外显率。
**研究结论**：本研究证实C9orf72六核苷酸重复扩增是葡萄牙中部地区FTD、ALS和FTD-ALS的重要遗传病因，凸显了常规基因检测在准确诊断、遗传咨询和临床管理中的价值。该葡萄牙队列的重复长度分布与其他欧洲人群大体一致，而PSP、CBD和AD中未检出扩增提示这些疾病具有不同的遗传基础。最后，研究发现20–23次重复的等位基因可能促成广泛的神经退行性表型易感性。然而，未来仍需整合遗传、临床和生物标志物数据的多中心纵向研究来验证这些发现，确立中间重复等位基因的致病和预后意义，并阐明其在神经退行性疾病易感性中的作用。
