《Frontiers in Plant Science》：Comparative transcriptome analysis reveals putative transcription factors components of the regulatory network for cannabidiol biosynthesis in Cannabis sativa L
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背景：大麻二酚（Cannabidiol, CBD）作为大麻（Cannabis sativa L.）特有的次生代谢产物，广泛应用于医药、食品、化妆品及饲料领域。阐明其转录调控机制可为高CBD含量分子育种提供理论基础，然而大麻中CBD生物合成的调控网络在很大程度上
背景：大麻二酚（Cannabidiol, CBD）作为大麻（Cannabis sativa L.）特有的次生代谢产物，广泛应用于医药、食品、化妆品及饲料领域。阐明其转录调控机制可为高CBD含量分子育种提供理论基础，然而大麻中CBD生物合成的调控网络在很大程度上仍属未知。方法：研究人员对四种大麻组织进行转录组分析以筛选差异表达基因（Differentially Expressed Genes, DEGs）；结合短时序列表达挖掘（Short Time-series Expression Miner, STEM）分析与品系特异性表达关联分析，筛选与CBD生物合成酶基因相关的核心转录因子（Transcription Factors, TFs）；应用酵母单杂交（Yeast One-Hybrid, Y1H）与酵母双杂交（Yeast Two-Hybrid, Y2H）实验验证关键TFs的结合与蛋白互作关系，并于烟草叶片中进行亚细胞定位实验。结果：通过对四种CBD含量不同的组织进行转录组分析，鉴定出1314个在雌花中特异性上调的基因，并利用STEM聚类为19个表达谱，其中表达谱8包含16个TFs与6个CBD生物合成通路相关酶基因，其趋势与四组织CBD含量变化一致。16个TFs中有7个呈现品系特异性相似表达模式，且与6个酶基因表达水平呈正相关；Y1H实验发现CsMYB6与CsMYB29分别结合4个和2个CBD生物合成酶基因启动子；Y2H实验揭示CsMYB6与CBD生物合成调控因子CsMYB1、CsWRKY1互作，CsMYB29与CsWRKY1互作；二者均定位于细胞核。结论：本研究鉴定的CsMYB6与CsMYB29两个TFs为理解大麻CBD生产的复杂调控机制提供了宝贵视角，并为CBD含量的遗传改良提供了遗传资源。
研究背景与立项依据
大麻（Cannabis sativa L.）为重要经济作物，其非精神活性次生代谢物大麻二酚（Cannabidiol, CBD）因抗炎镇痛等药理活性被广泛用于医药、食品与化妆品，而另一主要大麻素Δ9-四氢大麻酚（Tetrahydrocannabinol, THC）具精神活性在多国受限。提高CBD含量是中国等区域高CBD品种短缺背景下的核心育种目标，但大麻雌雄异株、异花授粉导致传统育种周期长、效率低。已有研究确认CBD酸合成酶（Cannabidiolic Acid Synthase, CBDAS）为CBD合成关键酶，但单纯过表达CsCBDAS仅使CBD含量提升约54%，且CBD含量受多基因位点控制，表明仅靠结构基因不足以培育高CBD品种，亟需解析转录调控网络。此前仅少数TFs如CsMYB1、CsWRKY1、CsMYB106被报道参与调控，网络复杂度远未被揭示。该研究即在此背景下，以组织特异性转录组学为主线挖掘雌花偏好性TFs，构建CBD生物合成转录调控模型。
主要技术方法概括
研究人员以中国农业科学院麻类研究所提供的‘C4’‘C7’‘C2’‘YDM1’‘YM6’五个大麻品系为材料，取‘C4’开花期雌花、根、茎、叶四种组织及四个品系雌花进行RNA-Seq转录组测序；采用DESeq2筛选差异表达基因（DEGs），利用短时序列表达挖掘（STEM）将雌花上调基因聚类，结合GENIE3与Cytoscape构建基因调控网络（Gene Regulatory Network, GRN）；以RP-HPLC-UV定量CBD与THC；通过qRT-PCR在品系水平验证TF表达趋势；使用酵母单杂交（Y1H）验证TF与酶基因启动子结合，酵母双杂交（Y2H）验证TF间及TF与已知调控因子蛋白互作；并于烟草叶片瞬时表达GFP融合蛋白进行亚细胞定位。
研究结果
3.1 不同组织CBD含量测定
研究人员测定‘C4’四组织总CBD含量，雌花最高（48.03 mg/g），其次叶、茎，根最低（1.09 mg/g），THC亦在雌花最高，确立雌花为CBD合成优势组织。
3.2 转录组测序与DEGs鉴定
对四组织各三重复测序，干净读数映射率平均92.24%；雌花相对根、茎、叶两两比较后去重叠，获11572个非冗余DEGs（6092上调、5480下调），其中雌花特异性上调1314个、下调183个。
3.3 雌花特异性上调DEGs与STEM分析
对1314个上调基因作STEM聚类得19个表达谱，表达谱8（Profile 8）趋势与四组织CBD含量一致，含197个基因，其中6个为CBD通路酶基因（AAE6-1、AAE6-2、CBDAS、OAC、PKSG4-1、PKSG4-2），16个为TFs（含MYB6、MYB29、MYB106、bHLH113等）；KEGG显示该谱富集于黄酮与苯丙烷生物合成。关联分析表明10个TFs与6酶基因正相关，7个TFs表达与CBD含量显著正相关。
3.4 不同CBD水平品系中TF表达谱
在‘C7’‘C2’‘YDM1’‘YM6’雌花qRT-PCR验证，CBD含量C7＞C2＞YDM1＞YM6；16个TFs中7个（含CsMYB6、CsMYB29）表达趋势与品系CBD含量一致，被推定为关键调控因子。
3.5 TFs调控CBDA生物合成验证
Y1H显示仅CsMYB6与CsMYB29结合CsCBDAS启动子（该启动子含MYB、MBSI、G-Box元件）；进一步Y1H表明CsMYB6还可结合CsAAE6-1、CsAAE6-2、CsPKSG4-1启动子，CsMYB29结合CsAAE6-2启动子。Y2H表明CsMYB6与CsMYB1、CsWRKY1互作，CsMYB29仅与CsWRKY1互作，提示形成MYB-WRKY蛋白复合体协同调控。
3.6 CsMYB6与CsMYB29亚细胞定位
烟草叶片瞬时表达PB121-CsMYB6-GFP与PB121-CsMYB29-GFP， confocal观测GFP信号均限于细胞核，符合转录因子定位特征。
讨论部分总结
研究人员指出MYB类TFs普遍通过结合靶启动子调控药用植物酚类代谢，CsMYB6与CsMYB29为雌花偏好性MYB，与CBD而非THC含量协同，且直接结合CsCBDAS与CsAAE6-2等核心结构基因启动子，并与已报道的CsMYB1、CsWRKY1物理互作，说明其作为CBD专线调控节点而非广义大麻素调控因子。其余5个正相关TFs可能经其他靶标或非CBDAS依赖途径起作用，CsMYB106延续既往镉胁迫下调控腺毛与CBD合成的角色，值得转基因验证。研究者坦言STEM本为时序工具，此处用于非时序比较转录组系因样本量不足WGCNA，且Y1H/Y2H后仍需转基因功能互补确证。
结论部分翻译
本研究鉴定了参与CBD生物合成的两个推定TFs，揭示了CBD生物合成背后复杂的转录网络。基于关联分析与qRT-PCR，7个TFs被确定为CBD生物合成关键推定调控因子。其中CsMYB6与CsWRKY1及CsMYB1互作，并结合CsCBDAS、CsAAE6-1、CsAAE6-2、CsPKSG4-1启动子；CsMYB29与CsMYB1互作，结合CsCBDAS与CsAAE6-2启动子。尽管仍需遗传修饰验证等深入研究以完全阐明这些TFs调控CBD生物合成的机制，本研究仍对CBD生物合成通路调控机制的现有知识体系作出了贡献。该论文发表于《Frontiers in Plant Science》。
